[发明专利]脂肪组织来源复合细胞群及其制备方法与应用

说明书

本发明公开了脂肪组织来源复合细胞群及其制备方法和应用。本发明所提供的脂肪组织来源复合细胞群的制备方法，包括如下步骤：(1)洗涤脂肪组织；(2)分离脂肪组织，所述洗涤后的脂肪组织依次经过1.5mm～2.0mm、0.8mm～1.0mm和0.5mm～0.7mm三种不同孔径的刀片式纳米脂肪移植乳化器，离心后将油滴层、成熟脂肪细胞层和生理盐水层去除，收集底部的复合细胞群层；用细胞筛过滤除去复合细胞群层中的细胞碎片和基质成份部分，离心，弃上清，即得所述脂肪组织来源复合细胞群。本发明通过在切割作用下破碎脂肪组织，降低了对脂肪组织的作用力，避免了对间充质干细胞等目标产物造成损伤，从而保护了细胞结构，提高了产物的治疗效果。

技术领域

本发明属于干细胞治疗领域，具体地说，涉及脂肪组织来源复合细胞群及其制备方法和应用。

背景技术

现有技术采用酶消化法制备脂肪组织来源复合细胞群，但酶消化法存在很多不足，限制了脂肪组织来源多细胞成分的临床应用，具体如下：

1、酶消化法常用胶原蛋白酶(牛源性)、胶原蛋白酶合并胰蛋白酶(猪源性)，消化脂肪细胞间的胶原蛋白、蛋白质，以获取其中的脂肪组织来源复合细胞群细胞成分，并用牛血清白蛋白(BSA)终止胰蛋白酶的反应，使用了动物源性消化酶，操作复杂，成本较高，以及生物安全隐患。

2、酶消化法为保证细胞活力，分离时需要添加人血清白蛋白，使用了稀缺人类资源来源的药品，成本较高。

3、酶消化分离的细胞可见大量红色团块，显微镜下观察可见大量圆形均一形态细胞，目前清除红细胞污染的方法一是使用红细胞裂解液，利用低渗原理裂解红细胞，再者或使用淋巴细胞分离液通过密度梯度离心法，二种方法使用的试剂均非医学品，红细胞污染较严重，成本较高。

申请号为201180068607.8的中国专利申请公开了一种从脂肪组织获得的源自超声空化的基质或间充质血管提取物和源自其的细胞以及其用途，该发明提供的处理方法，其使用超声空化解离脂肪组织内所含有的脂肪细胞和血管且由此获得用于人类个体的间充质或基质血管部分。但超声空化无差别破坏细胞，会损伤间充质干细胞等目标产物，破坏细胞结构，影响产物的治疗效果。

申请号为201380044693.8的中国专利申请公开了一种通过超声空化从脂肪组织分离干细胞及使用方法，在一个实施例中，该发明涉及用于从脂肪组织分离干细胞的非酶分离方法，其中方法包括用超声空化处理脂肪组织以破碎所述脂肪组织和溶解成熟的脂肪细胞，产生含有可存活的间质细胞/干细胞的间质血管成分。同样地，超声空化无差别破坏细胞，会损伤间充质干细胞等目标产物，破坏细胞结构，影响产物的治疗效果。

发明内容

为弥补以上领域的不足，本发明提供了一种脂肪组织来源复合细胞群的制备方法，以保护细胞结构，提高产物的治疗效果。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

脂肪组织来源复合细胞群的制备方法，包括如下步骤：

(1)洗涤脂肪组织：将获得的脂肪混合物首次离心，取上层脂肪组织，加入生理盐水，再次离心，直至生理盐水澄清，即得洗涤后的脂肪组织；

(2)分离脂肪组织：将所述步骤(1)洗涤后的脂肪组织加入螺旋式锁口注射器Ⅰ，用刀片式纳米脂肪移植乳化器将加入脂肪组织的螺旋式锁口注射器Ⅰ与另一个螺旋式锁口注射器Ⅱ连接，将所述脂肪组织经所述刀片式纳米脂肪移植乳化器推注至螺旋式锁口注射器Ⅱ中；

(3)所述洗涤后的脂肪组织依次经过1.5mm～2.0mm、0.8mm～1.0mm和0.5mm～0.7mm三种不同孔径的刀片式纳米脂肪移植乳化器，每孔径需经过10次以上处理；

(4)将经过刀片式纳米脂肪移植乳化器处理后的脂肪组织收集于离心管中，加入生理盐水，离心分离；离心后的脂肪分为四层，自上向下依次为油滴层、成熟脂肪细胞层、生理盐水层和复合细胞群层；