[发明专利]用于华法林用药相关基因分型检测的试剂盒和检测方法

说明书

本发明属于基因扩增检测的技术领域，具体涉及华法林用药相关基因分型的检测试剂盒和检测方法，首创性的发现在基因扩增检测中使用纳米二氧化硅，可以显著提高基因扩增的反应效率和反应特异性，为此将其应用到华法林用药相关基因分型的检测中，解决了现有技术中华法林用药基因分型检测特异性差、检测速度慢，不能满足对大量样本的快速的、特异性高的检测的问题。

技术领域

本发明属于基因扩增检测的技术领域，具体涉及华法林用药相关基因分型的检测试剂盒和检测方法。

背景技术

华法林(warfarin)是香豆素口服抗凝药，常用于人工瓣膜置换、血栓栓塞性疾病及房颤的抗凝治疗。由于华法林治疗窗口较窄，在临床使用过程中，稳定治疗剂量在不同个体间不尽相同，若药量不足会导致血栓的形成，若药量过大则会增加出血风险。据估计，服用华法林的患者中，每年有15.2％的人发生出血副作用，其中致命性的大出血占3.5％。不同个体间华法林稳定剂量的差异可达20倍以上。药物基因学研究证明，华法林的靶酶VKORC1和代谢酶CYP2C9的基因遗传多态性是影响华法林用药剂量差异性的重要因素。因此，研究VKORC1和CYP2C9基因的单核苷酸多态性(SNP)对于华法林维持剂量影响的研究十分重要。

随着基因研究的技术手段不断进步，发展出了多种SNP基因分型检测方法。SNP基因分型方法主要有：等位基因特异性杂交、引物延伸、特异性酶切和寡核苷酸连接等。实时荧光定量PCR是目前研究基因最有效、最普及的手段，并且已用于临床诊断。因此，借助实时荧光定量PCR技术实现的Taqman探针法SNP分型检测是临床基因分型诊断的不二之选。

Taqman探针研究SNP分型的试剂已在科研领域广泛应用。ThermoFisher公司已开发出超过700万种SNP检测的试剂盒。然而，目前应用于临床SNP分型检测试剂盒不超过100种，究其原因，发现制约其发展的关键因素是特异性差、操作繁琐、检测速度慢。提高核酸检测特异性的传统方法为引物设计、探针设计或反应物比例优化。如中国专利文献CN108179097A公开的一种实时荧光定量PCR检测EB病毒C/D基因分型试剂盒，采用EB病毒通用引物和C型和D型双特异荧光探针，开发研制出用于EB病毒C/D基因型分型的检测试剂盒。上述方案利用荧光定量PCR技术，设计了C/D基因型分型的特异探针，比传统的巢式PCR结合酶切鉴定的方法更加简便，快速和准确。然而上述方案仅通过实时荧光定量PCR技术结合特异探针，对于提高基因分型特异性、检测速度仍然有限，不能满足对大量样本的快速的、特异性高的检测。

为解决上述问题，本发明在开发一种快速的、特异性高的基因扩增检测方法过程中，首创性的发现在基因扩增检测中使用纳米二氧化硅，可以显著的提高反应效率和反应特异性，基于此，本发明开发了一种用于华法林用药相关基因分型检测的试剂盒和检测方法，提高了华法林相关基因分型检测反应的灵敏度和特异性，缩短了核酸扩增信号放大所需时间，使基因分型检测更方便临床应用。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于现有技术中的华法林用药相关基因分型检测试剂盒检测时间长，特异性低，进而提供一种快速的、特异性高的用于华法林用药相关基因分型检测的试剂盒和检测方法。

为解决上述问题，本发明提出了以下的技术方案：

本发明提供了一种用于华法林用药相关基因分型检测的试剂盒，包括独立包装的核酸扩增试剂、基于华法林用药相关基因设计的引物和基于华法林个体化用药相关基因设计的荧光探针；所述核酸扩增试剂中包括纳米二氧化硅。

所述的试剂盒，所述纳米二氧化硅的粒径为50～500nm。优选的，所述纳米二氧化硅为球状。

优选的，上述的试剂盒，所述纳米二氧化硅的制备方法如下：将溶液I和溶液II混合后在100℃-120℃的温度下反应得到；所述溶液I为氨水、水、无水乙醇按照体积比(10-30)∶(0.5-2)∶(68-89.5)混合的溶液，所述溶液II为正硅酸乙酯(TEOS)与无水乙醇按照体积比(15-30)∶(70-85)混合的溶液。