[发明专利]新型多功能双荧光素酶报告基因质粒

权利要求书

1.一种新型多功能双荧光素酶报告基因质粒，其特征在于，所述质粒包含luc萤火虫荧光素酶基因、Rluc海肾荧光素酶基因、SV40 poly(A)终止信号元件以及两种独立的多克隆位点，所述两种多克隆位点分别位于所述luc萤火虫荧光素酶基因编码框的上游和下游。

2.根据权利要求1所述的新型多功能双荧光素酶报告基因质粒，其特征在于，所述luc萤火虫荧光素酶基因编码框上游和下游各引入一个独立的所述多克隆位点。

3.根据权利要求2所述的新型多功能双荧光素酶报告基因质粒，其特征在于，所述质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

4.根据权利要求2所述的新型多功能双荧光素酶报告基因质粒，其特征在于：所述luc萤火虫荧光素酶基因编码框上游引入的所述多克隆位点引入启动子序列后，能用于基因转录调控检测。

5.根据权利要求2所述的新型多功能双荧光素酶报告基因质粒，其特征在于：所述luc萤火虫荧光素酶基因编码框下游引入的多克隆位点引入3’UTR序列后，能用于miRNA靶标鉴定。

6.一种构建权利要求1-5任意一项所述新型多功能双荧光素酶报告基因质粒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)缺失突变pmirGLO双荧光素报告基因质粒载体中的PGK启动子，同时引入MCS启动子多克隆位点；

(2)从PGK启动子缺失突变的pmirGLO质粒中克隆Amp抗性基因序列、ori载体复制起始序列、MCS启动子多克隆位点、luc萤火虫荧光素酶基因，3’UTR多克隆位点以及SV40 Poly(A)终止信号元件序列；

(3)从pRL-TK海肾荧光素酶报告基因质粒中克隆得到HSV-TK单纯性疱疹病毒脑腺激酶基因启动子序、Rluc海肾荧光素酶序列以及SV40Poly(A)终止信号元件序列；

(4)通过酶切连接，将步骤2和3中获得的DNA片段重组成完整的质粒，转化至DH5α大肠杆菌克隆，经测序鉴定后获得目标质粒pGLDr-Basic。