[发明专利]新型多功能双荧光素酶报告基因质粒

说明书

本发明公开了一种新型多功能双荧光素酶报告基因质粒，所述质粒包含luc萤火虫荧光素酶基因、Rluc海肾荧光素酶基因、SV40 poly(A)终止信号元件以及两种独立的多克隆位点，所述两种多克隆位点分别位于所述luc萤火虫荧光素酶基因编码框的上游和下游。本发明成功地构建了包含检测基因和内参基因的双荧光素酶报告基因质粒，利于向受试细胞转入检测基因的同时，能相应带入内参基因，极大地降低了实验操作的复杂性和实验误差，该质粒在萤火虫荧光素酶基因的两端拥有多克隆位点，位于萤火虫荧光素酶上游的多克隆位点能引入启动子序列，可用于基因转录调控检测，位于萤火虫荧光素酶下游的多克隆位点能引入3’UTR序列，可用于miRNA靶标鉴定，实现同种质粒不同用途之间的转换。

技术领域

本发明涉及分子生物学和基因工程领域，尤其涉及一种新型多功能双荧光素酶报告基因质粒。

背景技术

荧光素酶是生物体内催化荧光素或脂肪酫氧化发光的一类酶的总称。荧光素酶可以催化荧光素形成氧化荧光素，在荧光素氧化过程中，发出生物荧光，生物荧光的强弱可被化学发光仪检测并记录。荧光素酶报告基因系统是以荧光素为底物来检测荧光素酶活性的一种报告系统，可极其灵敏、高效地检测基因的表达，是检测基因转录或翻译调控的重要检测方法。

在用荧光素酶定量检测基因表达时，通常使用第二个报告基因作为内参基因，配合检测基因，以减少实验误差。目前，市场上绝大多数双荧光素酶报告基因系统将检测基因和内参基因分别置于两个独立的质粒上，如普洛麦格公司的pGL4荧光虫荧光素酶报告基因质粒和pRL-TK海肾荧光素酶报告基因质粒。在实际操作过程中，向供试细胞同时转染检测基因和内参基因两种质粒，可能增大实验的操作误差。

为了克服分别转染检测基因和内参基因所带来的弊端，普洛麦格公司还推出一种双荧光素酶报告基因质粒pmirGLO，该质粒同时包含了检测基因luc萤火虫荧光素酶和内参基因Rluc海肾荧光素酶，该质粒的使用极大的方便了双荧光素酶报告基因检测系统的操作过程，降低了实验操作误差。然而，pmirGLO中固定的启动子只能在大多数哺乳动物细胞中启动子基因表达，极大的限制了该miRNA靶标鉴定质粒的运用范围，并且pmirGLO只在萤火虫荧光素酶的下游引入了多克隆位点，该质粒只能运用于miRNA靶标鉴定，而无法运用于启动子活性调控鉴定等其它双荧光素酶报告基因检测研究。

发明内容

本发明的目的是构建一种同时包含检测基因和内参基因的双荧光素酶报告基因质粒，并在制备的质粒中引入用于插入外源基因片段的多克隆位点，可用于基因转录调控研究或miRNA靶标鉴定研究，方便报告基因质粒在不同实验目的和不同细胞系之间灵活应用。

为了实现本发明的上述目的，本发明采用以下技术方案：所述质粒包含luc萤火虫荧光素酶基因、Rluc海肾荧光素酶基因、SV40 poly(A)终止信号元件以及两种独立的多克隆位点，所述两种多克隆位点分别位于所述luc萤火虫荧光素酶基因编码框的上游和下游。

优选地，所述luc萤火虫荧光素酶基因编码框上游和下游各引入一个独立的所述多克隆位点。

优选地，所述luc萤火虫荧光素酶基因编码框上游引入的所述多克隆位点引入启动子序列后，能用于基因转录调控检测。

优选地，所述luc萤火虫荧光素酶基因编码框下游引入的多克隆位点引入3’UTR序列后，能用于miRNA靶标鉴定。

本发明的双荧光素酶报告基因质粒的构建方法如下：

(1)缺失突变pmirGLO双荧光素报告基因质粒载体中的PGK启动子，经测序后转化到大肠杆菌中扩大培养，并提取PGK启动子缺失突变后的pmirGLO质粒；

(2)从PGK启动子缺失突变的pmirGLO质粒中克隆Amp抗性基因序列、ori载体复制起始序列、MCS启动子多克隆位点、luc萤火虫荧光素酶基因，3’UTR多克隆位点和SV40 Poly(A)终止信号元件序列；