[发明专利]一种提取蜜环菌总DNA的试剂及其应用

说明书

本发明提供一种提取蜜环菌总DNA的试剂及其应用，可从50 mg左右其菌丝体和子实体样品中，经过破碎裂解、DNA吸附、漂洗、洗脱等步骤，快速高效的提取总DNA，针对新鲜的干样品，同样也可提取到适用于ITS鉴定等分子生物学实验的总DNA。进一步的实验证明，该方法也可以在灵芝、金针菇、香菇等食药用菌上应用。本方法单个样品提取时间缩短至15 min，且所提取的DNA完整性好、纯度高，可直接用于PCR、Real‑Time PCR、分子标记等下游分子生物学试验。

技术领域

本发明属于基因工程技术分子生物学领域，涉及一种提取蜜环菌总DNA的试剂及其应用，该方法开发了一种适用于PCR、Real-Time PCR、分子标记等下游分子生物学试验的快速蜜环菌等真菌的总DNA提取方法，可对蜜环菌等真菌的子实体、菌丝体及其他发酵产物等总DNA进行快速提取，提取产物可以用于分子生物学和遗传学的研究和分子鉴定。

背景技术

DNA是生命体中遗传信息的载体，包含了生物体的遗传性状。高质量、高纯度的总DNA是保证开展PCR扩增、限制性内切酶酶切、遗传图谱分析、分子杂交、遗传多样性分析以及基因组学等分子生物学研究的首要条件。因此，高效、快速制备高纯度、完整性好的总DNA样品显得极为重要。

目前，传统制备真菌总DNA的方法包括CTAB法、SDS法、碱裂解法和常规试剂盒方法等，CTAB法和SDS法采用离子型表面活性剂用于裂解真菌细胞，使基因组释放出来，再通过苯酚/氯仿/异戊醇等的多次抽提使蛋白质等沉淀于有机试剂中，最后经过异丙醇或者乙醇沉淀得到纯度高、完整性好的DNA分子。在这种方法中存在反复离心、沉淀、等待的工序，操作繁琐且耗时长，其提取过程需要2-3 h；且药品中苯酚、氯仿和异戊醇等有机溶剂具有毒性，对操作人员可能造成一定伤害；其次可能导致有机溶剂残留在总DNA样品中从而造成下游试验无法顺利进行。

常规试剂盒方法是在CTAB法、SDS法等常规方法等基础上结合DNA吸附柱进行优化，解决了DNA样品沉淀时间长和样品纯度低的缺点，且整个实验过程缩短到1h左右。但是，常规试剂盒方法提取过程中依然需要涉及氯仿、苯酚、β-巯基乙醇等有毒试剂。

碱裂解法直接利用强碱NaOH溶液使细胞膜溶解，蛋白变性，释放总DNA，再经过TE缓冲液对碱溶液稀释中和，从而得到了DNA溶液直接用于PCR扩增，是目前最为常见的快速简便提取总DNA的方法。该方法得到的DNA由于不经过任何纯化处理，含有大量色素、多糖和蛋白等物质，其含量和纯度都低不利于后续实验，且反应过程中强碱NaOH会打断DNA片段，导致该方法获得的DNA样品仅扩增上限为1000 bp左右的基因，而对于较长的基因片段而言，这种提取方法显然不适用。因此目前蜜环菌总DNA的提取方法有的操作复杂用时长，有的用到苯酚、氯仿、巯基乙醇等有毒物质，有的DNA完整度差。因此，针对以上不足并通过对现有提取技术的改进发明了本方法，具有安全、快速、简便、高效、产物完整度高、经济等优点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种提取蜜环菌总DNA的试剂及其应用，通过多次优化实验流程和试剂配方，总结出一种安全、快速、简单、高效提取蜜环菌总DNA的方法。该方法利用硅酸铝陶瓷纤维膜与DNA在不同盐离子浓度和pH条件下的结合程度不同从而达到提取、分离、纯化DNA的目的。本方法操作安全、快速、简单，15 min就能完成整个总DNA的制备过程，提取过程中原料用量少、无需酚、氯仿抽提，避免了有机溶剂对操作人员的污染；实验结果显示，总DNA完整性好，纯度高，适用于PCR、SSR、ISSR、qPCR等实验。从而解决了现有提取技术样品用量大、耗时长、试剂有毒、提取的DNA片段较短等缺点，以满足蜜环菌等珍贵材料分子生物学实验的需要。

具体操作步骤如下：

（1）向DNA吸附柱SC中加Balance Buffer 200 μL，10,000 rpm离心1 min，弃废液，对DNA吸附柱进行预处理；