[发明专利]一种提取长根菇基因组DNA的试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种提取长根菇基因组DNA的试剂盒及方法。该剂盒的组成包括：（1）平衡液：1%Na₂SiO₃·9H₂O，1%NaOH；（2）裂解液：5.0M盐酸胍，25%异丙醇和1%PVP K30；（3）洗涤液：20mM NaCl，20 mM Tris‑HCl，85%乙醇，pH7.5；（4）洗脱液：10mM Tris‑HCl，pH8.5；（5）DNA吸附柱。本发明提取长根菇基因组DNA的试剂无苯酚、氯仿等有毒物质，更安全；提取方法简便、高效，提取时间缩短至15min；提取产物纯度高、完整性好，能够直接用于分子生物学和遗传学研究。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种提取长根菇基因组DNA的试剂盒及方法。

背景技术

DNA是生命体中遗传信息的载体，包含了生物体的遗传性状。高质量、高纯度的总DNA是保证开展PCR扩增、限制性内切酶酶切、遗传图谱分析、分子杂交、遗传多样性分析以及基因组学等分子生物学研究的首要条件。因此，高效、快速制备高纯度、完整性好的总DNA样品显得极为重要。

目前，传统制备真菌总DNA的方法包括CTAB法、SDS法、碱裂解法和常规试剂盒方法等，CTAB法和SDS法采用离子型表面活性剂用于裂解真菌细胞，使基因组释放出来，再通过苯酚/氯仿/异戊醇等的多次抽提使蛋白质等沉淀于有机试剂中，最后经过异丙醇或者乙醇沉淀得到纯度高、完整性好的DNA分子。在这两种方法中存在反复离心、沉淀、等待的工序，操作繁琐且耗时长，其提取过程需要2-3 h；且药品中苯酚、氯仿和异戊醇等有机溶剂具有毒性，对操作人员可能造成一定伤害；其次可能导致有机溶剂残留在总DNA样品中从而造成下游试验无法顺利进行。

常规试剂盒方法是在CTAB法、SDS法等常规方法等基础上结合DNA吸附柱进行优化，解决了DNA样品沉淀时间长和样品纯度低的缺点，且整个实验过程缩短到1h左右。但是，常规试剂盒方法提取过程中依然需要涉及氯仿、苯酚、β-巯基乙醇等有毒试剂。

碱裂解法直接利用强碱NaOH溶液使细胞膜溶解，蛋白变性，释放基因组DNA，再经过TE缓冲液对碱溶液稀释中和，从而得到了DNA溶液直接用于PCR扩增，是目前最为常见的快速简便提取基因组DNA的方法。该方法得到的DNA由于不经过任何纯化处理，含有大量色素、多糖和蛋白等物质，其含量和纯度都低，不利于后续实验，且反应过程中强碱NaOH会打断DNA片段，导致该方法获得的DNA样品扩增上限仅为1000 bp左右的基因，但对于较长的基因片段而言，这种提取方法显然不适用。

长根菇（Oudemansiella radicata），又称小奥德蘑、长根金钱菌，商品名黑皮鸡 ，自然界主要分布在北温带地区，亚热带地区也有分布，热带地区罕见分布，是食用菌中的上品，肉质细嫩，柄脆可口，富含蛋白质、氨基酸、脂肪、碳水化合物、维生素和微量元素等多种营养成分，食用价值高。菇中富含长根素，有强烈的降血压作用，产品在北京、上海、广州、深圳等大城市广受欢迎。随着现代生物技术的发展，长根菇分子生物学的研究也逐步深入，但由于长根菇子实体中含有大量黏性的多糖类物质等干扰，因此目前长根菇基因组DNA的提取方法有的操作复杂用时长，有的用到苯酚、氯仿、巯基乙醇等有毒物质，有的DNA完整度差。因此，针对以上不足并通过对现有提取技术的改进发明了本方法，具有安全、快速、简便、高效、产物完整度高、经济等优点。

发明内容