[发明专利]一种iCAR-NK细胞的制备方法在审
| 申请号： | 201811103062.X | 申请日： | 2018-09-20 |
| 公开（公告）号： | CN109136192A | 公开（公告）日： | 2019-01-04 |
| 发明（设计）人： | 顾雨春;尹乐;谭声江 | 申请（专利权）人： | 北京呈诺医学科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N5/10 | 分类号： | C12N5/10;C12N5/0783;C12N15/90 |
| 代理公司： | 北京超凡志成知识产权代理事务所(普通合伙) 11371 | 代理人： | 李青 |
| 地址： | 100000 北京市*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 制备 位点 分化 受体编码基因 慢病毒感染 插入位置 基因插入 基因领域 基因修饰 嵌合抗原 无限增殖 增殖周期 外周血 细胞 | ||
1.一种iCAR-NK细胞的制备方法，其特征在于，嵌合抗原受体编码基因插入到iPS细胞的AAVS1位点，得到的CAR-iPS细胞分化获得iCAR-NK细胞。
2.根据权利要求1所述的iCAR-NK细胞的制备方法，其特征在于，制备步骤如下：
构建携带有AAVS1位点附近同源序列和嵌合抗原受体编码基因的donor载体；
构建B2M基因敲除位点对应的CRISPR/Cas9载体；
所述携带有AAVS1位点附近同源序列和嵌合抗原受体编码基因的donor载体、所述B2M基因敲除位点对应的CRISPR/Cas9载体转入iPS细胞，筛选得到CAR-iPS细胞；
所述CAR-iPS细胞诱导分化得到所述iCAR-NK。
3.根据权利要求2所述的iCAR-NK细胞的制备方法，其特征在于，所述AAVS1位点附近同源序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求2所述的iCAR-NK细胞的制备方法，其特征在于，所述iPS细胞为B2M基因缺失的iPS细胞。
5.根据权利要求2所述的iCAR-NK细胞的制备方法，其特征在于，构建的B2M基因敲除位点对应的CRISPR/Cas9载体通过转染293T细胞验证其对基因组DNA的内切活性。
6.根据权利要求2所述的iCAR-NK细胞的制备方法，其特征在于，所述转入为电转。
7.根据权利要求6所述的iCAR-NK细胞的制备方法，其特征在于，所述电转的参数为：电压1200V，时间间隔为18-25ms，电击次数为2-5次。
8.根据权利要求7所述的iCAR-NK细胞的制备方法，其特征在于，所述电击时间间隔为18-25ms，电击次数为2-5次。
9.根据权利要求2所述的iCAR-NK细胞的制备方法，其特征在于，所述转入后，使用puro筛选挑取单克隆，然后进行验证。
10.根据权利要求9所述的iCAR-NK细胞的制备方法，其特征在于，所述验证采用PCR扩增验证。
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