[发明专利]一种iCAR-NK细胞的制备方法

说明书

本发明涉及基因领域，特别涉及一种iCAR‑NK细胞的制备方法。一种iCAR‑NK细胞的制备方法，嵌合抗原受体编码基因插入到iPS细胞的AAVS1位点，得到的CAR‑iPS细胞分化获得iCAR‑NK细胞。本发明制备的iCAR‑NK细胞由CAR‑iPS分化获得，iPS细胞可增殖周期长，更便于进行基因修饰。相对于慢病毒感染获得的iCAR‑NK细胞，CAR‑iPS分化获得的iCAR‑NK纯度更高，可以接近于100％；基因插入位点均为AAVS1位点，插入位置明确，安全性更高；由于iPS可近乎无限增殖，因此由CAR‑iPS获得的iCAR‑NK也可近乎无限获得，不受外周血分离影响。

技术领域

本发明涉及基因领域，具体而言，涉及一种iCAR-NK细胞的制备方法。

背景技术

现有CAR-NK的制备主要是通过慢病毒感染对原代NK细胞进行基因修饰。

如申请号为201710025330.X提供了一种CAR修饰的NK细胞的制备方法，构建嵌合抗原受体基因重组到病毒载体上并转染NK细胞；所述CAR基因的cDNA构建在病毒载体中，并转染NK细胞，再将NK细胞培养到第21天，获得CAR NK细胞；通过荧光定量PCR技术检测，转染了CAR病毒载体的NK细胞其表达CAR基因高于未转染的NK细胞为50倍以上；所获得的CAR NK细胞能高表达CAR基因，可特异结合表达信号淋巴细胞激活分子家族成员的肿瘤细胞，并抑制NK细胞抑制性受体表达，阻止了肿瘤细胞免疫逃避，同时激活第一信号和共刺激信号；其高表达其特异标志物CD16。

如申请号为201710209997.5提供一种CAR NK细胞及其制备方法与应用。所述方法包括：S1、将特异性抗体编码基因连接到经改造的CAR骨架的克隆位点区中获得CAR基因，所述经改造的CAR骨架包括依次连接的CD244上膜信号区、克隆位点区、CD244胞外铰链区、CD244跨膜部分区与CD244胞内部分区，S2、将所述CAR基因通过慢病毒感染NK细胞，得到表达所述CAR蛋白的NK细胞，即所述CAR NK细胞。本发明所制备的肿瘤免疫治疗细胞CAR NK细胞除可应用于癌症患者本人外，也可以应用于异体回输。因此，本发明所制备的肿瘤免疫治疗细胞与现有的CAR T相比，使用范围更广，制备成本更低。

如申请号为201610821268.0公开了一种联合制备CAR NK细胞和CAR NKT细胞的方法，该方法包括以下步骤：1)将外周血单个核细胞加入细胞培养基中，预活化其中的NK细胞和NKT细胞，再选择性体外活化扩增NK细胞和NKT细胞；2)用携带有嵌合抗原受体的基因序列的慢病毒载体转导步骤1)所得混合细胞。该方法使用健康供者的NK和NKT可以进行标准化和批量化制备；另外本申请中NK细胞和NKT细胞的纯度无需纯化即可分别达到60％和30％以上，因此可以避免预先纯化；使用该方法联合制备的CAR NK细胞和CAR NKT细胞可通过临床用药来控制其在体内的活化增殖程度及存续时间。

如申请号为201710673358.4公开了一种针对小细胞肺癌的Car NK细胞的制备方法，该方法包括如下步骤：采集患者外周血并通过Ficoll法分离NK细胞；将人外周血单个核细胞置于NK培养基中，调整细胞浓度后置于培养箱中连续培养48 72h，收集贴壁细胞；将细胞加入至NK培养基中，继续培养12 15d，每3d补充一次培养液；将慢病毒对NK细胞进行转染并扩增培养，获得CAR NK细胞；制备小细胞肺癌细胞制剂。