[发明专利]一种CD40联合PD-L1及细胞因子扩增PBMC的方法

权利要求书

1.一种CD40联合PD-L1及细胞因子扩增PBMC的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）取正常人外周血，与PBS混合稀释后进行Ficoll密度梯度离心；

2）离心结束后，得到4层液体；用移液管吸取中间云雾层细胞，然后用10倍体积的PBS洗涤离心，最后得到PBMC；

3）将PBMC细胞用RMPI1640完全培养基配成细胞悬液，然后转入6孔板和24孔板里，然后于各组细胞培养液中加入相应细胞因子液：然后将孔板放到CO₂培养箱内培养；

4）视细胞状态每隔2~3天补加一次细胞因子液；

其中，所述细胞培养液中加入相应细胞因子液，其过程为：

CD40激发组，起始时，即第0天，加入浓度为2μg/ml的5C11，浓度为1μg/ml的PD-L1，浓度为30ng/ml的抗CD3mAb，浓度为300U/ml的IL-2，浓度为5ng/ml的IL-7，浓度为5ng/ml的IL-15;

其中，补加细胞因子液时，CD40激发组，补加浓度为200U/ml的IL-2、浓度为2ng/ml的IL-7、浓度为2ng/ml的IL-15。

2.根据权利要求1所述的CD40联合PD-L1及细胞因子扩增PBMC的方法，其特征在于，所述的Ficoll密度梯度离心为：先将提前置于室温条件的Ficoll加入华氏管中，然后按照Ficoll：稀释血液=1：2的比例，沿管壁缓慢加入稀释血液，然后于控温离心机中离心。

3.根据权利要求1所述的CD40联合PD-L1及细胞因子扩增PBMC的方法，其特征在于，所述的CO₂培养箱内培养条件为：CO₂浓度为5%、温度为37℃、饱和湿度95%。

4.根据权利要求1所述的CD40联合PD-L1及细胞因子扩增PBMC的方法，其特征在于，所述的离心，条件为1800rpm/min，30min，20~24℃。

5.根据权利要求1所述的CD40联合PD-L1及细胞因子扩增PBMC的方法，其特征在于，所述的RMPI1640完全培养基含10%小牛血清。

6.根据权利要求1所述的CD40联合PD-L1及细胞因子扩增PBMC的方法，其特征在于，所述的6孔板为：5.0×10⁶/孔；所述的24孔板为：2.0×10⁵/孔。