[发明专利]一种CD40联合PD-L1及细胞因子扩增PBMC的方法

说明书

本发明公开了一种CD40联合PD‑L1及细胞因子扩增PBMC的方法，步骤如下：1）取正常人外周血，与PBS混合稀释后进行Ficoll密度梯度离心；2）离心结束后，得到4层液体；用移液管吸取中间云雾层细胞，用10倍体积的PBS洗涤离心，得到PBMC；3）将PBMC细胞用RMPI1640完全培养基配成细胞悬液，转入6孔板和24孔板里，然后于各组细胞培养液中加入相应细胞因子液：将孔板放到CO₂培养箱内培养；4）视细胞状态每隔2~3天补加一次细胞因子液。本发明从CD40信号联合PD‑L1及细胞因子IL‑15和IL‑7组合扩增PBMC制备新型过继免疫治疗细胞为切入点，提供一种新的过继免疫细胞的体外诱导方案。此外，本发明所提供的方法实验设备要求低、操作简单省时、过继免疫细胞的收集率高、纯度高。

技术领域

本申请涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种CD40联合PD-L1及细胞因子扩增PBMC的方法 。

背景技术

恶性肿瘤是严重危害人类健康的重要疾病之一。目前，手术、放疗、化疗仍是主要的处理方法。但复发率和死亡率还是很高。过继细胞免疫治疗（ACT）正成为当今继放化疗后治疗恶性肿瘤的一种新的治疗手段，主要通过致敏淋巴细胞（具有特异免疫力的）输给肿瘤病人，使其获得抗肿瘤免疫力。

过继免疫疗法的效应细胞具有异质性，如细胞毒性T细胞（CTL）、自然杀伤细胞（NK）、巨噬细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞(lymphokine-activatedkillercells, LAK)和肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor-infiltrating lympbocytes，TIL)等都在肿瘤细胞杀伤中起作用。

外周血单个核细胞（PBMC），是指外周血中具有单个核的细胞，包含淋巴细胞、单核细胞（monocyte）、树突状细胞和其它少量细胞（造血干细胞等）。

新型过继免疫细胞细胞治疗技术是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子(CD3McAb，IL-2, IFN-γ,IL-1α等)共同培养一段时间后获得的一群以 CD3⁺CD56⁺、CD3⁺CD8⁺细胞为主的异质细胞群，增殖速度快、杀瘤活性、高杀瘤谱广、对多重耐药肿瘤细胞敏感，对G0期细胞也有杀伤作用、杀瘤活性不受环抱素A(CsA)和FKSO6等免疫抑制剂的影响、对正常骨髓造血前体细胞毒性小、能抵抗肿瘤细胞引发的效应细胞经Fas-FasL分子途径介导的凋亡。

常规以CD3McAb联合细胞因子IL-2, IFN-γ,IL-1α诱导的新型过继免疫细胞细胞治疗仍然存在着很多亟待解决的问题：由于用IL-2维持后期T细胞的增殖，而IL-2诱导的淋巴细胞中负性共刺激分子PD-1/PD-L1比例相当高。并且大剂量IL-2的应用会诱导一定数量的调节性T细胞（Treg），这可能是影响新型过继免疫细胞疗效的关键因素。

发明内容

本申请的主要目的在于提供一种新的CD40联合PD-L1及细胞因子扩增PBMC的方法。需要说明的是，本发明所提供的方法是一种过继免疫细胞的体外诱导方法，并非是针对活体的研究，也并非是以疾病治疗为直接目的的。

负性共刺激分子在T细胞的表达在T细胞介导的肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用。PD-1是55KD的跨膜蛋白，由胞外的IgV样基序、跨膜区、胞内的ITIM（immun oreceptortyrosine-based inhibitory motif）和ITSM（immunoreceptor tyrosine-based switchmotif）基序组成。它表达于T细胞、B细胞和胸腺细胞等，并在细胞活化后上调表达。PD-1与其配体PD-L1结合后，可导致T细胞凋亡和衰竭、T细胞耐受、改变细胞因子的分泌、增殖减弱和效应T细胞的细胞毒性降低，不能产生有效的抗肿瘤免疫应答，使肿瘤细胞发生免疫逃逸。