[发明专利]评估目标区域文库的建库污染程度的方法和优化文库构建的方法

说明书

一种评估目标区域文库的建库污染程度的方法和优化文库构建的方法，其中评估目标区域文库的建库污染程度的方法包括：提供多个合成模板、真实样本和阴性样本作为建库起始材料，合成模板是指根据所述目标区域的已知序列合成的模板序列，真实样本是指包含目标区域序列的样本，阴性样本是指不含任何核酸材料的样本；在建库用多孔板上分别使用合成模板、真实样本和阴性样本进行文库构建，获得测序文库；对测序文库进行上机测序获得测序数据，然后将测序数据比对到目标区域的参考序列，获得比对正确的有效数据；根据合成模板、真实样本和阴性样本各自的有效数据，评估各文库的污染来源及其比例。该方法能够有效评估和控制建库中的污染。

技术领域

本发明涉及文库构建技术领域，具体涉及一种评估目标区域文库的建库污染程度的方法和优化文库构建的方法。

背景技术

免疫组库是以T淋巴细胞或B淋巴细胞为研究目标，多重PCR或5’RACE结合高通量测序为技术手段，扩增重排后的V(D)J基因或V(D)JC基因(图1)，全面评估免疫系统的多样性，识别并量化体内免疫应答增殖克隆，从而对免疫学基础、疾病机理和药物开发等进行研究。

如今在高通量测序的时代，文库构建已进入自动化。在文库构建时经常用多孔板(如96孔板)进行自动化建库，提高建库通量，降低人工成本。但是在进行免疫组库96孔板建库时，需要有效评估和控制污染，该技术对污染序列极其敏感，数据分析需要精确到克隆。所以在免疫组库技术中涉及到克隆分析的精确性，污染的克隆及频率会影响分析结果，在建库过程中，应尽量降低和避免污染，所以需要一个量化的指标来衡量污染的程度，并且使污染达到一个可接受的范围。

目前，在免疫组库技术应用中，还没有相关报道提出如何评估污染的程度，但是关于如何降低污染，只有iCubate全自动生物大分子检测技术平台可以做到独特的全封闭，一次性使用卡盒设计避免任何交叉污染和PCR产物污染，同时还能够应用于环境监测，包括水质、空气的污染。一次性使用的全封闭设计确保整个过程的密闭操作，有效避免了交叉污染，杜绝了高浓度PCR产物对试验环境产生的污染。虽然可以建立全封闭的操作平台隔绝环境的污染，但是也无法避免样本与样本之间的交叉污染。所以还是需要一套可以评估现有技术流程的污染程度的方法，了解污染的特征和频率，然后用信息分析的方法将数据过滤，使结果更加精确。然而，目前仍然缺乏一套系统性评估免疫组库技术污染程度和特征的方法。

发明内容

本发明提供一种评估目标区域文库的建库污染程度的方法和优化文库构建的方法，能够有效评估和控制建库中的污染。

根据第一方面，一种实施例中提供一种评估目标区域文库的建库污染程度的方法，包括：

提供多个合成模板、真实样本和阴性样本作为建库起始材料，其中，上述合成模板是指根据上述目标区域的已知序列合成的模板序列，上述真实样本是指包含目标区域序列的样本，上述阴性样本是指不含任何核酸材料的样本；

在建库用多孔板上分别使用上述多个合成模板、真实样本和阴性样本进行文库构建，获得合成模板、真实样本和阴性样本的测序文库；

对上述测序文库进行上机测序获得上述合成模板、真实样本和阴性样本的测序数据，然后将上述测序数据比对到上述目标区域的参考序列，获得比对正确的有效数据；

根据上述合成模板、真实样本和阴性样本各自的上述有效数据，评估各文库的污染来源及其比例。

作为本发明的优选方案，上述评估各文库的污染来源及其比例包括如下至少一项：

(a)上述阴性样本的来源于上述合成模板、真实样本和其它来源的污染情况以及各自的比例；

(b)上述合成模板的来源于上述合成模板、真实样本和其它来源的污染情况以及各自的比例；和

(c)上述真实样本的来源于上述合成模板的污染情况以及各自的比例。