[发明专利]一种高产维生素B12的突变菌株制备方法

权利要求书

1.一种高产维生素B12的突变菌株制备方法，其特征在于涉及的脱氮假单胞菌的具体诱变工艺步骤如下：

（1）出发菌悬液制备：取两株出发菌株的新鲜斜面，用无菌水洗脱菌体，在有玻璃珠的试管振荡使菌体分散，离心收集菌体，以5％甘油重悬菌体，以血球计数板计数直至菌浓为10⁷-10⁸个/mL，制得出发菌悬液；

（2）诱变：开启常温常压等离子出发系统，以酒精棉擦拭操作室内外空间，并开启紫外灯灭菌30min，灭菌结束后取10μL菌悬液点于载片的粗糙面，并在无菌条件下将载片以镊子转移至操作室台面上；开启氦气阀门，设定气流量和诱变时间进行诱变；诱变时间分别设定为90s、120s、150s、180s、210s；

（3）菌落计数：每次诱变结束后均将载片置于含990μL无菌生理盐水的EP管中，漩涡震荡1min；稀释涂布后置于30+2℃，50+5%相对湿度下培养5天，对长出的单菌落进行观察计数；

（4）菌株初筛：从各处理组分分别挑取20个单菌落进行斜面传代以及后续的摇瓶初筛；

（5）菌株复筛：从初筛结果中选出效价高的突变菌株，经反复多次复筛，选出前10%的突变菌株再进行复筛，复筛时一株作三个平行，对挑选出的典型诱变菌株，逐一进行发酵摇瓶考察，选择起步效价、放瓶单位和菌浓均较高的菌种，即为含有生产维生素B12的突变菌株。

2.根据权利要求1所述的高产维生素B12的突变菌株制备方法，其特征在于涉及的筛选平板和传代斜面的培养基组成包括：甜菜糖蜜7.0-9.0%，硫酸铵0.45%，硫酸镁2.5%，硫酸锰0.2%，硫酸锌0.5%，磷酸氢二铵2.75%和琼脂1.2-1.5g/L，其余为水，除已经标注的外，各浓度均为重量百分比浓度；其pH值为7.0-7.5。

3.根据权利要求1所述的高产维生素B12的突变菌株制备方法，其特征在于涉及的菌株初筛中筛选种瓶用的培养基组成重量百分比包括：甜菜糖蜜5.0-7.0%，硫酸铵0.45%，硫酸镁2.5%，硫酸锰0.2%，硫酸锌1.2%，氯化钴0.05%，5,6-二甲基苯并咪唑（DMBI）0.05%和磷酸氢二铵2.75%，其余的为水，其pH值为7.0-7.5。

4.根据权利要求1所述的高产维生素B12的突变菌株制备方法，其特征在于涉及的菌株复筛中的筛选摇瓶的培养基重量百分比组成包括：甜菜糖蜜8.0-11.0%，蔗糖1.8%，氯化胆碱1.5%，硫酸铵0.45%，硫酸镁2.5%，硫酸锰0.2%，硫酸锌1.2%，氯化钴0.05%，5,6-二甲基苯并咪唑（DMBI）0.05%，尿素0.05%和磷酸氢二铵2.75%，其余为水，其pH7.0-7.5。

5.一种突变菌株TP-121实现工业发酵生产维生素B12的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）种瓶制备：将斜面菌用无菌水洗下后接入种瓶培养，30℃，200rpm，发酵2d，发酵结束后将种子液收集到3L的无菌瓶中，得到种子罐的种瓶；

（2）种子罐培养：将种瓶接种到种子罐中，30℃，180-300rpm，发酵48h；

（3）发酵罐培养：在无菌条件下，按照8％的接种量，将种子罐发酵液压入发酵罐，进行发酵罐培养；30℃，180-300rpm，发酵至60h后控制溶氧20％-30％，40h开始补料，发酵至菌体自溶严重，单位无明显提高时放罐；

其中，种子培养基质量百分比组成如下：糖蜜10%-12%，硫酸铵2.0%-2.5%，磷酸氢二铵0.5%-1.0%，硫酸锰0.1%-0.2%，硫酸镁1.2%-1.5%，硫酸锌0.5%-0.8%，其余为水，pH7.0-7.5；

发酵培养基质量百分百组成如下：糖蜜12％-15％，（NH₄)₂HPO₄0.5％-1％，硫酸铵1％-2％，氯化钴0.03％，5,6-二甲基苯并咪唑（DMBI）0.1％-0.15％，甜菜碱2％-3％，硫酸镁2.0%-3.0%，碳酸钙1.0-1.5%，其余为水，pH7.0-7.5；

补料培养基以糖蜜或葡萄糖作为补料碳源，其总糖浓度为150-200g/L。