[发明专利]一种高产维生素B12的突变菌株制备方法

说明书

本发明属于生物工程中的菌种制备技术领域，涉及一株高产维生素B12成分的突变菌株及工业发酵技术,特别是一种高产维生素的突变菌株的生产培育方法；涉及的脱氮假单胞菌的具体诱变工艺步骤包括：出发菌悬液制备、诱变、菌落计数、菌株初筛和菌株复筛；其通过对原始菌株进行诱变后，再次通过常温常压等离子体（ARTP）诱变技术对一株具有典型诱变特征的菌株进行了诱变，最终获得遗传性质稳定、发酵水平较高的菌种；涉及的突变菌株TP‑121实现工业发酵生产维生素B12的方法包括如下步骤：种瓶制备、种子罐培养和发酵罐培养；其工艺原理可靠，操作步骤简单，技术条件成熟，菌种优质，维生素产量高，应用环境友好。

技术领域：

本发明属于生物工程中的菌种制备技术领域，涉及一株高产维生素B12成分的突变菌株及工业发酵技术,特别是一种高产维生素的突变菌株的生产培育方法。

背景技术：

维生素B12，又称钴胺素，是一系列含有以钴原子为中心的咕啉核和以5，6-二甲基苯并咪唑为碱基的核苷酸且对人和动物具有生物活性的咕啉累有机化合物的总称；维生素B12的化学结构如图1所示；目前主要通过利用费氏丙酸杆菌（Propionibacteriumfreudenreichii）和谢氏丙酸杆菌（Propionibacterium shermanii）的厌氧发酵以及利用脱氮假单胞菌（Pseudomonas denitrificans）进行的好氧发酵实现VB12的工业生产。近几十年来，世界各国科研和生产工作者们为了提高维生素B12的发酵式生产水平进行了不懈努力；如中国专利CN102453690A公布了一种脱氮假单胞菌发酵生产维生素B12高产菌株的诱变方法，通过化学诱变和低能离子注入诱变筛选获得一株突变菌种，使得发酵单位提高8-12%；中国专利号为CN101538599A的发明专利公开了一种利用最适的甜菜碱初始添加量和最适的甜菜碱补料量提高脱氮假单胞菌发酵生产维生素B12的方法；中国专利号CN101748177的发明专利公布了一种通过调整培养基中的钾离子浓度优化脱氮假单胞菌的发酵生产工艺，并对合成培养基进行了系统优化使得发酵单位有所提高。尽管这些现有技术和研究新成果也已经达到了一定的技术水平，生产的维生素质量也很好，但是利用诱变、DNA重组技术或其他新工艺方法获得优良菌株，提高维生素B12基因在受体菌中的表达水平，进一步优化维生素B12的发酵和提取工艺以及保存条件，仍然是维生素B12在各行业领域进行广泛探讨和应用的重要任务。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，寻求设计提供一种高产维生素B12的突变菌株的工业发酵方法，将其制备的突变菌株应用于工业生产中制取维生素B12。

为了实现上述目的，本发明的工艺技术中所述的高产维生素B12的菌株为脱氮假单胞菌(Aspergillus niger)TP-121，是由脱氮假单胞菌TY-007通过常温常压等离子体（ARTP）诱变筛选获得的高产菌株，其菌株形态特征在于镜检菌丝较短，菌形排列一致，着色较深，摇瓶后期菌丝拉长产生膨大端；其中，脱氮假单胞菌TY-007是一株经紫外诱变筛选得到的高产维生素B12菌株，其发酵水平较原始菌提高了10.8%，该菌经液体培养后菌丝较长，易相互缠绕，致使发酵液粘稠，不利于发酵后期的传质和传氧，也不利于提取工段操作，将其作为出发菌种再次诱变；本菌种的最适生长温度为30℃，生长所需的pH范围为7.3-7.5；所述脱氮假单胞菌株TP-121所产维生素B12达到320-350ug/mL。

本发明涉及的脱氮假单胞菌的具体诱变工艺步骤如下：

（1）出发菌悬液制备：取两株出发菌株的新鲜斜面，用无菌水洗脱菌体，在有玻璃珠的试管振荡使菌体分散，离心收集菌体，以5％甘油重悬菌体，以血球计数板计数直至菌浓为10⁷-10⁸个/mL，制得出发菌悬液；