[发明专利]一种抗体进化方法及其应用

说明书

本发明提供一种抗体进化方法，所述抗体进化方法包含以下步骤：1）提供单碱基基因编辑系统，所述单碱基基因编辑系统可形成单碱基基因编辑复合体，所述单碱基基因编辑复合体包括dCas9酶、sgRNA、MS2胞嘧啶脱氨酶融合蛋白，所述sgRNA靶向待进化抗体的可变区基因；2）利用1）中所述的单碱基基因编辑系统对待进化抗体的可变区基因进行碱基突变，表达突变抗体，获得突变抗体库；3）筛选并富集高亲和力抗体。本发明通过对细胞进行基因编辑，真正实现了抗体基因的定范围自主突变。并通过结合后续的流式分选技术，从而定向选择抗体的进化，提高抗体进化效率。

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，特别是涉及一种抗体进化方法及其应用。

背景技术

面对复杂的生存环境，人体适应性免疫系统中的免疫细胞可以通过多样化其细胞受体来识别不同的抗原或病原体。例如：多样化的B细胞受体和T细胞受体是B或T细胞介导的免疫反应中各类病原体识别的分子基础。B细胞受体可以分为膜结合型或分泌型，其中分泌型B细胞受体又被称为抗体。抗体是体液免疫的重要分子，它由两条相同的重链和轻链组成，其中N端由于其组成氨基酸具有多样性，也被称为可变区，能够识别并结合抗原分子，决定了抗体的特异性。可变区通过半胱氨酸形成的二硫键连接成三级结构。其中，暴露在可变区结构域外端的高变区的序列多样性最为显著，它们能与抗原表位形成互补结构域，又被称为互补决定区(CDR)。而可变区的其他位置的氨基酸序列相对CDR区域而言更为保守，可被称为框架区(FWR)。CDR1和CDR2位于V_H或V_L元件内部，而CDR3位于V_HD_HJ_H或V_LJ_L的连接区，序列多样性最为明显(Hwang et al.,2015)。抗体分子的C端序列氨基酸组成相对稳定，被称为恒定区。重链的恒定区一般有五种类型，μ、δ、γ、ε以及α，它们通过与不同的下游免疫反应分子相作用，从而介导不同的免疫反应。

据估计，人类一生可以产生多达10⁹种类的抗体，足以识别5×10¹³种抗原。如果每一种抗体分子都对应不同的编码基因，那这将大大超出人类基因组的最大容量。事实上，在我们的机体内，存在着抗体分子多样化的复杂机制，使得我们可以利用少量的基因元件，组成基因序列极为丰富的初级抗体库。在免疫B细胞发育早期，细胞需要经历V(D)J重排，淋巴细胞中特异表达的重排酶RAG(Recombination-Activating Gene)能在V,D,J元件的编码基因附近产生DNA双链断裂(DSB)，并通过招募下游的多种非同源末端连接蛋白对不同的元件进行连接，最终拼接产生抗体可变区。人体和小鼠中，重排过程能形成约10⁵-10⁶不同类型的抗体分子。重排后的细胞成功表达了B细胞受体(BCR)，但此时表面的BCR亲和力较低，对致病菌中和作用较低，且分子多为IgM亚型。当同源B细胞遇到对应抗原后将迅速被激活，细胞快速分裂分化并迁移至生发中心的暗区，成为生发中心母细胞。在生发中心中，B细胞将经历体细胞高频突变(SHM)和抗体类型转换(CSR)两大过程，从而表达高效力抗体。这两个过程均由胞嘧啶脱氨酶(AID)介导，通过对单链DNA上的胞嘧啶N4位的氨基进行脱氨，从而使得胞嘧啶转化成为尿嘧啶，并通过下游的错配修复途径，而在抗体基因簇上形成碱基高频突变，或被处理为DNA双链断裂。相较于正常状态下基因上每分裂一代产生的～10^-9的突变率，抗体可变区基因在高频突变过程中能产生约10^-5-10^-3的突变率。多样化的抗体分子组合成一个次级抗体库，其中表达抗原特异性的高亲和力抗体的B细胞可以在生发中心中被进一步的筛选出来，从而机体可以分泌各种高亲和力抗体。这一过程也被称为抗体的亲和力成熟。