[发明专利]GSDMD-N基因重组质粒及在乳腺表达的方法和应用

说明书

本发明公开一种GSDMD‑N基因重组质粒及在乳腺表达的方法和应用，通过构建GSDMD‑N基因的表达重组质粒，使其在乳腺组织及乳腺细胞内特异性表达，从而达到对金黄色葡萄球菌感染的乳腺炎的防治目的，属于基因工程领域。GSDMD‑N蛋白是近年发现的可以特异性的识别细菌的生物膜成分心磷脂并与之相结合，进而形成大量蜂窝状孔道，使细菌崩解死亡的多肽类化合物。本技术通过乳腺生物反应器，利用乳腺组织的特异性启动子WAP使外源基因GSDMD‑N在动物乳腺中高效表达，并以此杀灭造成奶牛乳腺炎的金黄色葡萄球菌，从而达到预防和治疗由金黄色葡萄球菌感染造成的奶牛乳腺炎的目的。本发明提供的重组质粒及重组减毒沙门菌具有高效、安全、成本低等优点，为防治金黄色葡萄球菌感染所致奶牛乳腺炎提供新途径，具有良好的应用前景。

技术领域：

本发明提供了一种GSDMD-N基因重组质粒，是由鼠GSDMD-N基因构建而成的；本发明进一步提供了GSDMD-N基因重组质粒及其在乳腺表达的方法；利用减毒沙门菌使其在牛乳腺细胞及鼠乳腺组织中表达的方法，从而达到利用GSDMD-N蛋白对金黄色葡萄球菌感染的乳腺炎的防治目的，属于基因工程技术领域。

背景技术：

Gasdermin家族是一种含有DFNA5结构域的但是功能未知的蛋白家族，该家族主要有12个成员，该家族蛋白主要在肠道上皮和胃肠道上皮中表达，该家族蛋白的突变会造成毛囊生长发育异常，同时该家族的蛋白表达异常与肿瘤的发生密切相关，Gasdermin家族的成员N端有介导细胞焦亡的功能。

Gasdmermin D (GSDMD)蛋白是近Gasdermin家族年来发现的天然免疫防御分子，其前体不具有生物活性。当PRRs识别外源性的PAMP，或内源性的DAMP激活炎性体后，募集接头蛋白ASC和激活Caspase-1，4，5，进而剪切GSDMD产生具有生物活性的N末端GSDMD-N蛋白。GSDMD-N蛋白可以特异性的识别细菌的生物膜成分磷脂并与之相结合，进而形成大量蜂窝状孔道，使细菌崩解死亡。目前关于GSDMD-N蛋白序列已成功检测，但其抗菌抑炎功能尚未见报道。

沙门菌是一种可产生局部或全身感染的侵袭性胞内菌，它和宿主之间通过III型分泌机制介导反应，这种机制使细菌的效应蛋白能直接转移到真核细胞发挥作用，使其可以传递表达效应基因并同时表达多种功能性蛋白。近年来通过基因工程技术能将沙门菌的致病基因敲除后得到减毒菌株，为沙门菌作为载体的安全性提供了保证。沙门菌SL7207是aroA基因缺失菌，aroA是合成5－烯醇丙酮酰莽草酸－3－磷酸合成酶的重要物质，而该酶参与氨基苯甲酸和二羟基苯甲酸代谢，进而合成芳香族氨基酸。因此，缺失aroA基因时，该菌不能完成上述反应，从而限制该菌的生长进而达到减毒的目的，该菌毒力虽然减弱可是却不影响其胞内侵袭性，所以SL7207减毒沙门菌可以做载体携带外源基因进入到宿主细胞进行表达。

发明内容：

本发明一种GSDMD-N基因重组质粒，使其在乳腺组织及乳腺细胞内特异性表达，从而达到对金黄色葡萄球菌感染的乳腺炎的防治目的。

本发明进一步提供了GSDMD-N基因重组质粒在乳腺表达的方法，通过基因工程扩增GSDMD-N基因，然后将其连接到含有WAP启动子的表达载体上，构成可以表达GSDMD-N蛋白的重组质粒；将其电转至减毒沙门菌SL7207上，由此获得携带GSDMD-N基因、WAP启动子的重组减毒沙门菌GSDMD-N-ORF；随后利用减毒沙门菌侵染牛乳腺上皮细胞以及鼠第四对乳腺，以此评价GSDMD-N重组质粒的表达效果及其在预防和治疗乳腺炎中的初步应用效果。并且该重组表达蛋白无明显的细胞毒性作用，对动物机体也无毒副作用。

本发明提供的一种GSDMD-N基因重组质粒，编码目的蛋白GSDMD-N的核苷酸序列如SEQ no.1所示。

本发明所述的GSDMD-N基因重组质粒构建及其在乳腺表达的方法，包括以下步骤：

1、本发明所述的重组质粒的质粒图谱如图1所示：