[发明专利]一种提高外源蛋白表达量的蛋白合成体系及其应用方法

说明书

本发明提供了一种提高外源蛋白表达量的蛋白合成体系及其应用方法，具体地，通过在编码eIF4E结合蛋白的核苷酸序列前插入强启动子序列构建的多核苷酸序列或载体，实现对Eap1p、p20等eIF4E结合蛋白过表达，并利用含有该改造的细胞裂解液进行外源蛋白合成。本发明提供了提高外源蛋白表达量的蛋白合成体系，本发明的合成体系可显著提高蛋白质翻译的效率。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体地，涉及一种提高外源蛋白表达量的蛋白合成体系及其应用方法。

背景技术

蛋白质是细胞中的重要分子，几乎参与了细胞所有功能的执行。蛋白的序列和结构不同，决定了其功能的不同。在细胞内，蛋白可以作为酶类催化各种生化反应，可以作为信号分子协调生物体的各种活动，可以支持生物形态，储存能量，运输分子，并使生物体运动。在细胞中，蛋白质翻译的调节在应对营养缺失等外界压力，细胞发育与分化等很多过程中发挥重要作用。蛋白质翻译的四个过程包括翻译起始、翻译延伸、翻译终止和核糖体再循环，其中受调控最多和限速的步骤是翻译的起始[1]。真核细胞的翻译起始可以分为两大类：“帽子结构”依赖的传统途径和“帽子结构”非依赖的途径。

在细菌的翻译起始过程中，30S小亚基在3种起始因子的介导下直接在起始密码子的AUG附近形成起始复合体。真核生物的翻译起始则较为复杂，需要11种起始因子，并且核糖体在起始蛋白质合成时与mRNA结合的位点与原核生物不同[2]。真核生物的具有“帽子结构”(cap structure,m7GpppN)的mRNA翻译起始主要是通过依赖“帽子结构”的扫描机制进行的[1-3]。直接与帽子发生相互作用的是eIF4F，由eIF4G蛋白同时结合RNA解旋酶eIF4A和eIF4E而组成的翻译因子起始复合物。其中的eIF4E是帽子结合蛋白，为真核生物蛋白质合成途径中的关键调控靶点。在哺乳动物细胞中，与eIF4E发生相互作用的蛋白4E-BPs(eIF4E-binding proteins)，通过结合eIF4E，使其不能和eIF4G结合，从而不能形成翻译起始复合物eIF4F，抑制依赖帽子结构的mRNA的翻译[4]。人源4E-BP1蛋白是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的底物之一，磷酸化水平受到mTOR信号通路的调控。当Thr37，Thr46和Ser65，Thr70残基被mTORC1先后磷酸化以后，4E-BP1将从eIF4E上解离，从而促进eIF4F起始复合物的形成和依赖帽子结构的翻译起始[5-6]。mTOR信号通路影响真核细胞中翻译起始及蛋白质合成，在细胞生长增殖过程中起重要作用。

mTOR是一类与细胞增殖紧密相关的丝/苏氨酸蛋白激酶,在进化上十分保守，从酵母到哺乳动物广泛存在，对细胞外包括生长因子，胰岛素，营养素，氨基酸，葡萄糖等多种刺激产生应答[7]。人类的编码TOR蛋白的基因和酵母中的同源性高达40％-60％[8]。在酵母体内没有和哺乳动物4E-BPs在结构上类似的蛋白，在功能上具有类似的结合eIF4E的蛋白有p20和EAP1p。这两种蛋白有一段高度相似的13个残基序列，其中包含了eIF4E的结合域YxxxxLΦ,x为任意氨基酸残基，Φ为疏水残基。除了这一段序列，这两种蛋白没有其他相似的地方，可能EAP1p还具有其他的功能会进一步影响TOR信号通路的下游[9]。对于其他真核生物的eIF4E结合蛋白，人源的4E-BP1、4E-BP2、鼠源的PHAS-I的蛋白序列都已有文献报道[10]。

制备的酵母裂解液中含有大量的蛋白质合成翻译机器，可以通过外源添加模板而合成目标蛋白。但是酵母原来的mRNA也会继续使用资源合成非目标杂蛋白，影响目标蛋白的合成效率和产量。本发明通过过表达Eap1p，与eIF4G竞争性结合eIF4E,减少翻译起始复合物eIF4F的形成，在体外抑制酵母裂解液中原来的mRNA帽子依赖的翻译过程，使更多的资源(如其他翻译因子，核糖体和氨基酸等)用于合成外源添加的不依赖帽子结构的体外蛋白合成体系模板，从而显著提高体外合成蛋白质的效率和产量。

然而，本领域目前的体外生物合成系统的蛋白翻译合成的效率还较低，难以令人满意，因此，本领域亟需开发一种新的可提高外源蛋白翻译合成效率的体系和方法。