[发明专利]一种广地龙的环介导等温扩增检测引物及基于LAMP技术鉴定广地龙的方法

权利要求书

1.一种广地龙的环介导等温扩增检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：

上游内引物FIP：5’-CAACAGCCGCAGACCTTACTATTTTAACATAAGATTTTGACTTTTGCC-3’；

下游内引物BIP：5’-GGACAGTTTACCCCCCTTTAGCTTTTGCTAAATGTAGTGAGAAAATTGCA-3’；

上游外引物F3：5’-CATAGCATTCCCACGTCTA-3’；

下游外引物B3：5’-ACCTAAAATTGATGAGGCAC-3’。

2.一种广地龙的环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于，包括环介导等温扩增反应液、Bst DNA聚合酶、阳性对照质控品、阴性对照质控品和检测引物，所述的检测引物如下所示：

上游内引物FIP：5’-CAACAGCCGCAGACCTTACTATTTTAACATAAGATTTTGACTTTTGCC-3’；

下游内引物BIP：5’-GGACAGTTTACCCCCCTTTAGCTTTTGCTAAATGTAGTGAGAAAATTGCA-3’；

上游外引物F3：5’-CATAGCATTCCCACGTCTA-3’；

下游外引物B3：5’-ACCTAAAATTGATGAGGCAC-3’。

3.根据权利要求2所述的广地龙的环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照质控品为含有广地龙的COⅠ基因的质粒DNA。

4.根据权利要求2所述的广地龙的环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于，所述的阴性对照质控品为ddH₂O。

5.一种基于LAMP技术鉴定广地龙的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取待测样品的基因组DNA作为模板；

（2）使用权利要求1所述的广地龙的环介导等温扩增检测引物，与环介导等温扩增反应液、Bst DNA聚合酶和待测样品的基因组DNA混合形成LAMP反应体系，进行环介导等温扩增反应，以阳性对照质控品和阴性对照质控品分别作为阳性对照和阴性对照；

（3）扩增反应完成后，通过与阳性对照和阴性对照进行对比，判断待测样品LAMP反应体系中是否扩增得到扩增产物，来判断待测样品是否为广地龙；

通过与阳性对照和阴性对照进行对比，判断待测样品LAMP反应体系中是否扩增得到扩增产物，来判断待测样品是否为广地龙具体为通过琼脂糖凝胶电泳法或SYBR Green I荧光染色显色法同时检测阳性对照、阴性对照和待测样品LAMP反应体系的扩增产物，根据是否有梯形条带或反应体系的颜色来判断待测样品是否为广地龙；

所述步骤（2）的LAMP反应体系总体积为25 μL：包括DNA模板1 μL，10 pmol/μL的FIP和BIP各4 μL，10 pmol/μL的F3和B3各0.5 μL，10×Bst DNA聚合酶缓冲液2.5 μL，10 mMdNTPs 3.5 μL、100 mM MgSO₄ 1.5 μL、ddH₂O 6.5 μL和8 U/mL Bst DNA聚合酶1 μL；所述步骤（2）的进行环介导等温扩增反应，其反应参数为：将LAMP反应体系中除Bst DNA聚合酶以外的其他组分混合，置于95℃水浴锅中水浴5 min，迅速放在冰上冷却，加入Bst DNA聚合酶，61-64℃恒温反应50-60 min，80℃孵育10 min；

所述的阳性对照质控品为含有广地龙的COⅠ基因的质粒DNA；

所述的阴性对照质控品为ddH₂O。