[发明专利]一种广地龙的环介导等温扩增检测引物及基于LAMP技术鉴定广地龙的方法

说明书

本发明公开了一种广地龙的环介导等温扩增检测引物及基于LAMP技术鉴定广地龙的方法。本发明针对广地龙的COⅠ基因，设计和筛选了一套特异性检测引物以及含有该检测引物的检测试剂盒和利用该检测试剂盒通过环介导等温扩增进而确定待测样品是否为广地龙的鉴定方法。本发明操作简单，结果检测只需肉眼观察，不需要昂贵的检测仪器，灵敏度比常规PCR高1000倍。本发明所需成本低，可应用于地龙商品的真伪鉴定。

技术领域：

本发明属于中药材资源鉴定技术领域，具体涉及一种广地龙的环介导等温扩增检测引物及基于LAMP技术鉴定广地龙的方法。

背景技术：

广地龙是环节动物门钜蚓科动物，是中国传统的动物中药材，其用药历史悠久，广地龙和广地龙类制剂在临床应用广泛。广地龙有多种药理作用，主要包括降压、平喘、解热抗炎、抗血栓、抗肿瘤等。地龙是中国民间传统用药，根据中国药典记载，地龙包括广地龙和沪地龙，其中广地龙的质量被认为行业品质最优。中国的品种较多，形态大小因品种差异而不同，加工成中药材后，增加了品种的辨别难度。经调查，中药材市场上地龙商品伪品较多，严重影响了中药材用药的稳定性和安全性，需要一种新的鉴定技术，快速完成地龙商品的鉴定。

等温环介导扩增技术(LAMP)是一种新的核酸扩增技术，反应可在恒温(60-65℃)条件30-60min内完成扩增。反应结束后，在反应液中加入荧光染料SYBR Green I，通过肉眼观察颜色变化即可判断结果。相比常规PCR技术，LAMP反应操作简单，耗时短，不需要昂贵的仪器设备，反应灵敏度高等有点。近几年，LAMP技术逐渐用于中药材鉴定和肉制品鉴定中，包括人参、冬虫夏草、木通、牛肉、猪肉等。但有关利用LAMP技术鉴定蚯蚓品种未见有报道。本发明利用LAMP鉴定技术应用于中药市场的广地龙商品鉴定中，减少市场伪品的混入，为中药材质量提供保障。

发明内容：

本发明的目的是提供一种灵敏度高、特异性强、检测时间短、对仪器设备要求低的广地龙的环介导等温扩增检测引物及基于LAMP技术鉴定广地龙的方法。

本发明的第一个目的是提供一种广地龙的环介导等温扩增检测引物，所述的检测引物如下所示：

上游内引物FIP：5’-CAACAGCCGCAGACCTTACTATTTTAACATAAGATTTTGACTTTTGCC-3’(如SEQ ID NO.1所示)；

下游内引物BIP：5’-GGACAGTTTACCCCCCTTTAGCTTTTGCTAAATGTAGTGAGAAAATTGCA-3’(如SEQ ID NO.2所示)；

上游外引物F3：5’-CATAGCATTCCCACGTCTA-3’(如SEQ ID NO.3所示)；

下游外引物B3：5’-ACCTAAAATTGATGAGGCAC-3’(如SEQ ID NO.4所示)。

本发明的第二个目的是提供一种广地龙的环介导等温扩增检测试剂盒，包括环介导等温扩增反应液、Bst DNA聚合酶、阳性对照质控品、阴性对照质控品和检测引物，所述的检测引物包括：

上游内引物FIP：5’-CAACAGCCGCAGACCTTACTATTTTAACATAAGATTTTGACTTTTGCC-3’(如SEQ ID NO.1所示)；

下游内引物BIP：5’-GGACAGTTTACCCCCCTTTAGCTTTTGCTAAATGTAGTGAGAAAATTGCA-3’(如SEQ ID NO.2所示)；

上游外引物F3：5’-CATAGCATTCCCACGTCTA-3’(如SEQ ID NO.3所示)；

下游外引物B3：5’-ACCTAAAATTGATGAGGCAC-3’(如SEQ ID NO.4所示)。

所述的阳性对照质控品优选为含有广地龙的COⅠ基因(如SEQ ID NO.5所示)的质粒DNA。