[发明专利]一种转移因子口服溶液中的核糖核酸定量检测方法

权利要求书

1.一种转移因子口服溶液中的核糖核酸定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)配制转移因子口服溶液核糖核酸含量测定供试品溶液

采用蛇毒磷酸二酯酶对转移因子口服溶液进行酶解，获得转移因子口服溶液核糖核酸含量测定供试品溶液；

2)构建核糖核酸的标准曲线方程

以鸟嘌呤脱氧核苷酸为对照品，配制线性系列溶液，利用高效液相色谱法检测获得色谱图，以鸟嘌呤脱氧核苷酸浓度对其峰面积按最小二乘法进行线性回归，得到标准曲线方程及线性相关系数；其中，高效液相色谱检测条件为：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂色谱柱；

以流动相A和流动相B进行梯度洗脱，其中：流动相A为甲醇；流动相B为pH值为3.55～3.65、浓度为0.1mol/L的磷酸二氢钾溶液；

检测过程中：波长为210～320nm，进样量为1～50μL，流速为0.6～1.0mL/min，柱温为33～37℃；

3)转移因子口服液中核糖核酸的检测

精密量取步骤1)制得的转移因子口服溶液核糖核酸含量测定供试品溶液，利用高效液相色谱法在与步骤2)相同的色谱检测条件下获得色谱图，由相对保留时间定位核糖核酸基本组成物质即4种核苷酸和4种核苷的色谱峰；

4)转移因子口服液中核苷酸类物质的含量计算

根据步骤2)获得的标准曲线方程和步骤3)的色谱峰，从标准曲线方程中求出各待测物质的含量，乘以相应的相对校正因子并加和即得核糖核酸含量。

2.根据权利要求1所述的转移因子口服溶液中的核糖核酸定量检测方法，其特征在于，步骤1)中，采用蛇毒磷酸二酯酶对转移因子口服溶液进行酶解，具体操作步骤如下：

步骤a：取蛇毒磷酸二酯酶，加缓冲液制成5IU/ml的溶液，每支1.5μl分装，用时加缓冲液13.5μl；所述缓冲液包括110mmol/L Tris-HCl，15mmol/LMgCl₂，110mmol/L NaCl，pH8.9；

步骤b：精密量取转移因子口服溶液3μl，加蛇毒磷酸二酯酶溶液15μl，涡旋混匀，置37℃反应30min后，加水至100μl，混匀，沸水浴5min，离心15min，取上清液，即完成酶解操作。

3.根据权利要求1所述的转移因子口服溶液中的核糖核酸定量检测方法，其特征在于，步骤2)中，构建核糖核酸的标准曲线方程具体操作步骤如下：

步骤a：精密量取鸟嘌呤脱氧核苷酸对照品20.0mg，置于100mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液；然后，分别精密量取对照品贮备液0.1mL、0.5mL、1.0mL、2.5mL及5mL，分别置于25mL量瓶中，加水稀释至刻度、摇匀，制得对照品系列溶液；

步骤b：分别精密量取上述标准曲线系列溶液各2μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，以鸟嘌呤脱氧核苷酸浓度对其峰面积按最小二乘法进行线性回归，求出标准曲线方程及线性相关系数。

4.根据权利要求1所述的转移因子口服溶液中的核糖核酸定量检测方法，其特征在于，利用高效液相色谱法，进行梯度洗脱时，流动相A与流动相B的变化比例如下：

0min，流动相A：2％、流动相B：98％；

10min，流动相A：2％、流动相B：98％；

10.1min，流动相A：15％、流动相B：85％；

20min，流动相A：15％、流动相B：85％；

20.1min，流动相A：2％、流动相B：98％；

30min，流动相A：2％、流动相B：98％。

5.根据权利要求1或4所述的转移因子口服溶液中的核糖核酸定量检测方法，其特征在于，十八烷基键合硅胶色谱柱的填料粒度为5～10μm，内径为2～5mm，长度为10～30cm。

6.根据权利要求1或4所述的转移因子口服溶液中的核糖核酸定量检测方法，其特征在于，流动相B的pH值为3.55；检测波长为260nm；进样量为2μL，流速为0.8mL/min，柱温为35℃。