[发明专利]一种转移因子口服溶液中的核糖核酸定量检测方法

说明书

本发明公开了一种转移因子口服溶液中的核糖核酸定量检测方法，属于多组分生化药物质量研究领域。方法包括：1)配制转移因子口服溶液核糖核酸含量测定供试品溶液；2)构建核糖核酸的标准曲线方程；3)转移因子口服液中核糖核酸的检测；4)转移因子口服液中核苷酸类物质的含量计算。该方法经过科学系统的验证，其能够实现对转移因子口服溶液中核糖核酸进行准确定量，排除其他物质的干扰且相邻组分峰间分离度佳，重现性好，检测效率高；该方法能够克服现有技术中的不足，以便对转移因子口服溶液的生产实施有效的监督控制。

技术领域

本发明属于多组分生化药技术分析领域，具体涉及一种转移因子口服溶液中的核糖核酸定量检测方法。

背景技术

转移因子(transter factor，简称TF)又称传输因子，是一种天然双向免疫调节剂，是目前治疗免疫功能低下、缺陷等相关疾病的理想药物。转移因子的主要成分为健康猪或牛脾脏中提取的多肽、氨基酸和核糖核酸。准确测定转移因子中的核糖核酸含量对于优化转移因子生产工艺及控制产品质量具有重要的意义。

从健康猪脾脏提取分离的核糖核酸(RNA)，是由几十至几千个核苷酸聚合而成的长链，每一种RNA都有一定的核苷酸排列顺序和二级、三级结构。现有技术核糖核酸含量测定的方法采用紫外吸收系数法，但因一方面样品中的杂蛋白和苯酚等在相同波长处均有吸收，干扰测定结果；另一方面RNA片段的长短以及二级结构状态会对吸光度值产生较大影响，导致测定结果不准确。

查阅相关文献，有采用高效液相色谱法测定核糖核酸含量的文献报道，但一般采用离子对-HPLC法或者离子色谱法进行分离，且只用于单独分离核苷酸或脱氧核苷酸。离子对色谱法平衡时间较长，且色谱峰容易漂移，色谱柱使用寿命短。如上所述，目前关于核糖核酸含量测定的研究尚少，因此目前法定对照品仅有4种脱氧核苷酸(腺嘌呤脱氧核苷酸、胞嘧啶脱氧核苷酸、胸腺嘧啶脱氧核苷酸、鸟嘌呤脱氧核苷酸)，其他4种核苷酸(腺嘌呤核苷酸、胞嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸、鸟嘌呤核苷酸)及4种核苷(腺嘌呤核苷、胞嘧啶核苷、尿嘧啶核苷、鸟嘌呤核苷)暂无法定对照品。

发明内容

为了克服上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种转移因子口服溶液中的核糖核酸定量检测方法，该方法能够实现对转移因子口服溶液中核糖核酸进行准确定量，排除其他物质的干扰且相邻组分峰间分离度佳，重现性好，检测效率高。

本发明是通过以下技术方案来实现：

本发明公开的转移因子口服溶液中的核糖核酸定量检测方法，包括以下步骤：

1)配制转移因子口服溶液核糖核酸含量测定供试品溶液

采用蛇毒磷酸二酯酶对转移因子口服溶液进行酶解，获得转移因子口服溶液核糖核酸含量测定供试品溶液；

2)构建核糖核酸的标准曲线方程

以鸟嘌呤脱氧核苷酸为对照品，配制线性系列溶液，利用高效液相色谱法检测获得色谱图，以鸟嘌呤脱氧核苷酸浓度对其峰面积按最小二乘法进行线性回归，得到标准曲线方程及线性相关系数；其中，高效液相色谱检测条件为：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂色谱柱；

以流动相A和流动相B进行梯度洗脱，其中：流动相A为甲醇；流动相B为pH值为3.55～3.65、浓度为0.1mol/L的磷酸二氢钾溶液；

检测过程中：波长为210～320nm，进样量为1～50μL，流速为0.6～1.0mL/min，柱温为33～37℃；

3)转移因子口服液中核糖核酸的检测

精密量取步骤1)制得的转移因子口服溶液核糖核酸含量测定供试品溶液，利用高效液相色谱法在与步骤2)相同的色谱检测条件下获得色谱图，由相对保留时间定位核糖核酸基本组成物质即4种核苷酸和4种核苷的色谱峰；