[发明专利]一种修复哺乳动物肠道损伤冻干粉的制备方法

权利要求书

1.一种修复哺乳动物肠道损伤冻干粉的制备方法,其特征在于，包括以下步骤：

(1)筛选培养对象并分离：脐带的筛选是选取孕妇年龄在22-28周岁，孕期≤40周，健康足月的新生儿脐带靠近婴儿端约20cm左右，置于含双抗的脐带采集液保存，于冰盒内尽快运输；

(2)脐带清洗及处理：置于无菌杯皿中用75％酒精快速清洗一遍，再用含双抗的无菌生理盐水反复冲洗，直至无明显血块；将脐带纵向剖开，剔除血管；用含双抗的无菌生理盐水将组织块漂洗干净，并用眼科剪将脐带分小段剪碎置于无菌杯皿中，再进一步将脐带剪碎至细小组织块；

(3)脐带组织培养：将组织块按照合适的密度接种于培养瓶底部，添加适量的含血清代替物的DMEM/F12培养液，将瓶身翻转瓶底想上放置于37℃，5％的CO2的培养箱中贴壁4h，然后翻转瓶身瓶底向下静置于培养箱中培养，定期观察更换或添加培养液；8d左右在显微镜下观察，可见组织块周围有成纤维状细胞爬出，去除组织块更换培养液继续培养2d左右，此时细胞为P0，用TrypLE消化将贴壁细胞转移到新的培养瓶中培养，此时细胞为P1；

(4)间充质干细胞传代培养：将步骤(3)中分离的细胞继续传代培养至P6，传代是当培养瓶中细胞生长达到80％融合时，TrypLE消化细胞，1∶4传代培养，开始收集P2至P6的培养上清；

(5)间充质干细胞培养上清离心、纯化和过滤除菌：将(4)中收集的培养上清液进行高速离心，重新用无菌无热原容器收集离心后上清；将离心后上清液浓缩处理，再通过过滤装置对浓缩液进行除菌并分装至无菌无热原瓶中；

(6)冻干粉的制备：冻干处理浓缩液，在浓缩液液中加入KFG以及冻干保护剂；经冷冻干干燥处理之后制成间充质干细胞因子冻干粉。

2.根据权利要求1所述的一种修复哺乳动物肠道损伤冻干粉的制备方法,其特征在于，采用含1％血清替代物的DMEM/F12(HEPES，NO PHENOL RED，L-GLUTAMINE)培养液培养人脐带间充质干细胞。

3.根据权利要求1所述的一种修复哺乳动物肠道损伤冻干粉的制备方法,其特征在于，步骤(1)中的脐带剪碎至细小组织块的直径尺寸为2mm-4mm。

4.根据权利要求1所述的一种修复哺乳动物肠道损伤冻干粉的制备方法,其特征在于，步骤(3)的培养瓶为是T75cm²无菌无热原TC表面透气型培养瓶，传代至P1的培养瓶为T175cm²无菌无热原TC表面透气型培养瓶。

5.根据权利要求1所述的一种修复哺乳动物肠道损伤冻干粉的制备方法,其特征在于，步骤(5)中收集的培养上清液是以3000r/min离心30min取离心后上清液，将多次收集的上清液储存于-20℃。

6.根据权利要求1所述的一种修复哺乳动物肠道损伤冻干粉的制备方法,其特征在于，步骤(5)的培养上清液过滤浓缩是将收集的培养上清液于室温解冻，通过0.45um滤膜过滤除掉参与细胞，在通过过滤膜超滤收集分子量在3～30KD的细胞因子的浓缩液，通过0.22um滤膜过滤除菌，将浓缩液收集。

7.根据权利要求1所述的一种修复哺乳动物肠道损伤冻干粉的制备方法,其特征在于，步骤(6)中加入KFG比例为0.01％；所述冻干保护剂成分包括：海藻糖、甘露醇、右旋糖酐以及人血清白蛋白。

8.根据权利要求1所述的一种修复哺乳动物肠道损伤冻干粉的制备方法,其特征在于，步骤(6)中加入冻干保护剂后，海藻糖在浓缩液中的体积百分比为1～8％，甘露醇在浓缩液中的体积百分比为1～8％，右旋糖酐在浓缩液中的体积百分比为1～5％，人血清白蛋白在浓缩液中的体积百分比为0.1～2％。

9.根据权利要求1所述的一种修复哺乳动物肠道损伤冻干粉的制备方法,其特征在于，步骤(6)中的经冷冻干干燥处理之后制成间充质干细胞因子冻干粉，其存储温度为2℃-4℃。