[发明专利]一种修复哺乳动物肠道损伤冻干粉的制备方法

说明书

本发明提供了一种修复哺乳动物肠道损伤冻干粉的制备方法，涉及生物干细胞技术领域，通过筛选培养对象并分离、脐带清洗及处理、脐带组织培养、间充质干细胞传代培养、间充质干细胞培养上清液处理以及冻干粉的制备等多重工艺手段，实现了制备出用于修复哺乳动物肠道损伤的含有高活性的脐带间充质干细胞分泌的多种细胞因子的试剂。

技术领域

本发明涉及生物干细胞技术领域，尤其涉及一种修复哺乳动物肠道损伤冻干粉的制备方法。

背景技术

间充质干细胞是指具有三胚层分化潜能的一类干细胞亚群，在特定环境下，理论上可以诱导分化为人体任何一种组织细胞，主要来源于人体中广泛存在的间质组织，特别是骨髓、脂肪、脐带和胎盘等，由于其具有强大的增殖能力，较强的分化能力，低免疫原性和免疫调节功能，其在临床上的应用价值越来越受人们关注。随着对间充质干细胞研究的不断深入，其分泌因子已成为研究的热点。间充质干细胞可以分泌多种细胞因子，这些细胞因子可有效地调控机体细胞信号传导、活化人体干细胞，进而生理性修复或替代机体损伤、病变及衰老的细胞。

有研究表明在培养的过程中脐带间充质干细胞能分泌多种细胞因子，如分泌表皮生长因子(Epidermal Growth Factor，EGF)，肝细胞生长因子(Hepatocyte GrowthFactor，HGF)，肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor，TNF)，血管内皮生长因子(Vascularendothelial Growth Factor，VEGF)，神经生长因子(Nerve Growth Factor，NGF)等，这些细胞因子都能在一定程度上促进皮肤细胞生长、改善细胞生长微环境、促进伤口愈合、延缓衰老、改善皮肤生长状态等作用,但是一般制备在用于修复哺乳动物肠道损伤时普遍活性下降，服用效果不明显，因此如何制备出用于修复哺乳动物肠道损伤的含有高活性的脐带间充质干细胞分泌的多种细胞因子的试剂成为了本领域技术人员亟待解决的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的不足，提供一种修复哺乳动物肠道损伤冻干粉的制备方法，该制备方法能够生产出用于修复哺乳动物肠道损伤的含有高活性的的脐带间充质干细胞分泌的多种细胞因子冻干粉。

本发明是通过以下技术方案予以实现：一种修复哺乳动物肠道损伤冻干粉的制备方法,包括以下步骤：

(1)筛选培养对象并分离：脐带的筛选是选取孕妇年龄在22-28周岁，孕期≤40周，健康足月的新生儿脐带靠近婴儿端约20cm左右，置于含双抗的脐带采集液保存，于冰盒内尽快运输；

(2)脐带清洗及处理：置于无菌杯皿中用75％酒精快速清洗一遍，再用含双抗的无菌生理盐水反复冲洗，直至无明显血块；将脐带纵向剖开，剔除血管；用含双抗的无菌生理盐水将组织块漂洗干净，并用眼科剪将脐带分小段剪碎置于无菌杯皿中，再进一步将脐带剪碎至细小组织块；

(3)脐带组织培养：将组织块按照合适的密度接种于培养瓶底部，添加适量的含血清代替物的DMEM/F12培养液，将瓶身翻转瓶底想上放置于37℃，5％的CO2的培养箱中贴壁4h，然后翻转瓶身瓶底向下静置于培养箱中培养，定期观察更换或添加培养液；8d左右在显微镜下观察，可见组织块周围有成纤维状细胞爬出，去除组织块更换培养液继续培养2d左右，此时细胞为P0，用TrypLE消化将贴壁细胞转移到新的培养瓶中培养，此时细胞为P1；

(4)间充质干细胞传代培养：将步骤(3)中分离的细胞继续传代培养至P6，传代是当培养瓶中细胞生长达到80％融合时，TrypLE消化细胞，1∶4传代培养，开始收集P2至P6的培养上清；

(5)间充质干细胞培养上清离心、纯化和过滤除菌：将(4)中收集的培养上清液进行高速离心，重新用无菌无热原容器收集离心后上清；将离心后上清液浓缩处理，再通过过滤装置对浓缩液进行除菌并分装至无菌无热原瓶中；