[发明专利]制备人脂肪干细胞培养液的方法及其在美容用品中的应用

说明书

本发明公开一种制备人脂肪干细胞培养液的方法及其应用，包括以下步骤：使用胰酶和胶原酶联合消化人源脂肪组织，待溶液分为三层，取下层，制得脂肪干细胞沉淀液；加入L‑DMEM完全培养基中终止消化并进行原代培养；对原代脂肪干细胞进行传代培养，该过程中提供O₂分压为1～5％、CO₂分压为5％的低氧气氛以及10～30mJ/cm²的紫外线照射，并加入1×10^‑7mol/L胰岛素，获得脂肪干细胞培养物；将脂肪干细胞培养物液离心，过滤，除去脂肪干细胞，得到滤液即为所述脂肪干细胞培养液。通过该培养方法可促进脂肪干细胞旁分泌，得到的脂肪干细胞培养液中含有多种旁分泌组分，且含量非常高。该脂肪干细胞培养液可作为活性物质，添加到护肤美容产品中，使得护肤美容品具有美白、祛疤、抗皱等功效。

技术领域

本发明涉及干细胞技术应用，具体地，涉及制备人脂肪干细胞培养液的方法及其在美容用品中的应用。

背景技术

脂肪干细胞是从脂肪组织中获得的间充质干细胞，自2001年首次从脂肪组织中分离、提取出脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)并命名以来，ADSCs因来源广泛、取材方便、组织损伤小、扩增迅速等优点已成为细胞治疗和组织工程应用中的理想工具。众多研究发现，ADSCs在体内损伤修复、抗衰老等方面均可发挥较为显著的作用；其生物学作用的实现一部分通过多向分化能力，ADSCs可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱等多种细胞，补充替代老化、缺损的组织细胞；另一部分通过旁分泌功能，ADSCs可合成及分泌多种细胞因子、多肽类、气体分子等活性成分，提高受损细胞的生命力和抗凋亡能力。

干细胞促进组织再生的机制包括分化和旁分泌两方面的作用。分化机制认为，幼稚的干细胞迁移到损伤部位，分化为与受区细胞相似表型的细胞，通过移植替代修复受损组织；旁分泌机制认为，干细胞分泌的生长因子、细胞因子和趋化因子影响受区多种细胞的存活、增殖、迁移和基因表达，而且作用效果有组织特异性。目前的研究认为，由于干细胞移植后成活率较低，干细胞通过分化发挥替代修复的作用有限。数天甚至数小时内短暂而明显的抗炎和促进增殖作用，很难用干细胞的分化修复来解释。此外，无细胞条件培养基具有改善受损组织功能的作用，同样也支持干细胞的旁分泌机制。大量研究表明，相比组织构建，干细胞通过复杂的旁分泌功能促进组织再生的作用可能更为关键。

ADSCs分泌的生物活性因子种类繁多。在体外培养脂肪干细胞的过程中，该细胞会将上述具有生物活性因子分泌到培养基中，形成脂肪干细胞条件培养基(Adipose-derivedstem cells conditioned medium，ADSC-CM)。 ADSC-CM中含有VEGF、IGF、TGF-β1、bFGF、EGF和KGF等多种活性成分。在ADSC-CM中还检测到多种抗氧化物质，包括IGF、IL-6、超氧化物歧化酶2(Superoxide dismutase 2，SOD2)和肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor，HGF)，对机体多种组织器官有抗氧化保护作用。例如，IGF 可以保护成纤维细胞和肠上皮细胞免受自由基损伤；HGF保护视网膜色素上皮免受由于谷胱甘肽减少造成的氧化损伤；白介素-6(Interleukin-6，IL-6) 可以减少过氧化氢造成的细胞死亡。因此，目前研究认为，ADSCs主要通过旁分泌的作用方式，分泌大量活性细胞因子，从而产生抗组织老化的作用。

紫外线照射引起的光老化是导致皮肤衰老的最主要外因。研究表明， ADSCs所分泌的胰岛素样生长因子、表皮生长因子、转化生长因子β、白细胞介素1和肿瘤坏死因子α，可改善中波紫外线引起的皮肤成纤维细胞损伤，加强成纤维细胞增殖及合成胶原蛋白的能力，其中转化生长因子β在体外实验中刺激成纤维细胞的作用最强。