[发明专利]基于辅助质粒和PCR产物的蓝舌病病毒反向遗传拯救方法及其应用

说明书

本发明公开了一种蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)的反向遗传方法和应用。本发明将辅助质粒和蓝舌病病毒PCR产物分两次转染BHK‑21细胞从而拯救病毒。本发明的蓝舌病病毒反向遗传拯救方法可用于BTV的致病机制研究、免疫机制研究以及重组疫苗的制备。

技术领域

本发明涉及一种病毒拯救方法，尤其是涉及一种蓝舌病病毒的拯救方法。

背景技术

蓝舌病(Bluetongue disease,BT)，是由BTV引起，通过吸血昆虫传播的反刍动物病毒性传染病,以口腔、鼻腔和胃肠道黏膜发生溃疡性炎症变化为特征。BTV为双股RNA病毒，其基因组包含10个节段，大小约为19kb。BTV为呼肠孤病毒科(Reoviridae)环状病毒属(Orbivirus)蓝舌病病毒亚群(Bluetingue virus subgroup)的成员之一，环状病毒属共有14个亚群，其中蓝舌病病毒亚群与鹿出血症病毒亚群有较强的交叉反应性。BT最早于1876年发现于南非的绵羊，由于发病绵羊持续高热，口腔出现溃疡损伤，口腔粘膜及舌头发蓝，因此，于1906年提议定名为“蓝舌病”，牛的BT发现于1943年。BTV几乎可以感染所有的反刍动物，包括家养和野生的牛、山羊和某些野生动物。牛、山羊、鹿及羚羊等野生反刍动物可长期带毒，并在疾病流行间歇期扮演着病毒宿主的角色。而吸血昆虫，特别是库蠓是其主要传播媒介。1940年前本病仅限于撒哈拉以南的非洲大陆，到40年代已蔓延至中东一些国家和地区，例如：塞浦路斯、叙利亚、伊拉克、土耳其、以色列和巴勒斯坦。1948年美国报道此病。70年代后期本病广泛分布于热带、亚热带国家。1956～1957年欧洲尤其是西班牙和葡萄牙流行。1978在澳大利亚的库蠓体内分离到BTV。目前，热带和亚热带地区绝大多数国家的易感动物都可能感染BTV或与之密切相关的病毒。我国于1979年在云南师宗首先发现本病并分离出BTV，从而确定了本病在国内的存在，随后在湖北(1983)、安徽(1985)、四川(1988)、甘肃(1990)、山西(1991)等29个省均检出BTV血清学阳性牲畜。近年来，随着全球气候变暖，BT在许多国家相继爆发，且分布范围不断扩大。2006年8月，德国、比利时、法国、荷兰等首次发现牛感染BT，2007年7月，英国、法国、意大利等国爆发本病。世界动物卫生组织(OIE)通报，2008年3月～4月，法国、意大利等国爆发了BT，2009年1月～12月，英国、法国、意大利、澳大利亚、希腊、以色列、丹麦、捷克、瑞典、挪威、西班牙、德国、奥地利、葡萄牙、匈牙利、荷兰、阿曼、阿尔及利亚、摩洛哥和突尼斯等国先后爆发BT。蓝舌病目前已经报道27个血清型，各个国家血清型分布不均一，到目前为止，并没有有效的疫苗来防治本病。我国已在多数省份和地区检测到该病，加之国际贸易中本病存在的风险，故我国急需加强对该病的研究，做好可对其进行防控和检测的技术储备。但由于BTV血清型较多，并且血清型还可以出现基因重组现象，更导致了该病防控的困难。

出于对有效防控BTV考虑，其机制研究和新型疫苗的研究越来越受到研究人员的关注。而反向遗传操作技术是解决以上问题的重要手段之一。目前主流的蓝舌病病毒反向遗传操作系统均采用基于辅助质粒和体外转录RNA的两步法转染方式。但这种方法存在的明显缺点在于，第二步转染用模板需要通过构建质粒，再大量培养细菌，大量提取质粒获得，并且提取的质粒需要经过酶切，纯化并达到一定浓度后方可作为体外转录的模板，然后用昂贵的体外转录试剂盒进行转录，再次经过RNA纯化方可获得第二步转染物。这一过程费时费力，并且在转录、转录产物电泳鉴定、纯化和转染等步骤均需要避免RNA酶的污染，转录的RNA产物由于其固有的特性，保存困难。这种转录方法操作步骤繁琐、试剂费用高、操作难度相对较大，对人员、环境、设备要求均较高，常常由于操作不当导致病毒拯救失败。此外，由于BTV某些血清型基因本身的原因，个别节段的基因很难构建入RNA转录模板质粒，甚至无法构建入RNA转录模板质粒，进而使病毒拯救无法进行。这种情况下急需一种方便快捷的反向遗传操作系统满足基础研究和应用研究的需要，为疫苗研发提供简单实用的技术手段。

发明内容

本发明提供一种无需制备RNA就可以拯救病毒，并且在病毒基因组无法插入质粒时，可以直接从病毒基因组克隆基因，实现病毒拯救的方法。