[发明专利]荧光蛋白的纯化方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体而言，提供了一种荧光蛋白的纯化方法。本发明提供的荧光蛋白的纯化方法，将细胞破壁液依次经沉淀和复溶处理后用离子交换层析进行纯化，得到荧光蛋白。该纯化方法简便高效，适用于所有表达系统中荧光蛋白的纯化，安全对环境没有污染，纯化成本低，纯化得到的荧光蛋白纯度高并且浓度高，该方法适用于工业化的生产与应用。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种荧光蛋白的纯化方法。

背景技术

1962年，旅居美国的日本科学家下村修对一种发光水母产生了兴趣，因为他发现这种水母在受到外界的惊扰后会发射绿色荧光。在从美国西海岸打捞了大约5万只发光水母后，通过艰苦的提取纯化工作，最终得到数百毫克的蛋白，其在508nm下自行发射绿色荧光，称之为绿色荧光蛋白。后人的研究发现，通过改造绿色荧光蛋白的氨基酸序列，在一个或数个位点进行突变，可以得到不同颜色的荧光蛋白如黄色荧光蛋白，蓝色荧光蛋白和青色荧光蛋白等。

荧光蛋白无需辅助因子和底物即可自行发射荧光，这一特性使其在生物实验中得到了广泛的应用。在实际应用中，某些场合需要一定量的高纯度荧光蛋白，此时，利用基因工程的方法来获得荧光蛋白，相较于从天然来源中提取的方法显然更简便、经济。基因工程的方法具体为：通过在表达载体上插入目的基因，然后将表达载体导入到相应的宿主细胞中，通过培养和诱导即可大量表达目的基因对应的蛋白。同时，因为荧光蛋白不需要翻译后修饰，选择原核表达系统来表达是合理的。

大肠杆菌是目前应用最广泛的原核表达系统，它的优势是分子操作简单，可在廉价的培养基中快速生长，且外源蛋白表达量通常较高。虽然很多蛋白在大肠杆菌中表达易形成无活性的包涵体沉淀，但可以通过优化培养和诱导的条件得到可溶性表达的目标产物。荧光蛋白一般都在胞内表达，细胞破碎后，荧光蛋白和菌体自身蛋白及其它大分子物质混杂在一起，因此，要将不带任何标签的荧光蛋白从细胞破碎后的溶液中分离纯化出来是一件困难的事情。

目前，利用荧光蛋白的一些特性，如耐受一定的有机溶剂、相对耐热、不易变性等，已经开发了一些分离纯化不带任何标签的荧光蛋白的方法，如双液相萃取、有机溶剂抽提、热处理等，但这些方法均存在纯化倍数低、工艺复杂、易引发环境污染等缺点。因而，寻找一种简单高效、经济同时适合大规模应用的荧光蛋白纯化方法显得十分必要。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种荧光蛋白的纯化方法，以缓解现有技术中荧光蛋白的纯化方法纯化倍数低、工艺复杂、易引发环境污染等技术问题。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种荧光蛋白的纯化方法，将细胞破壁液依次经沉淀和复溶处理后用离子交换层析进行纯化，得到所述荧光蛋白。

进一步地，所述沉淀包括在所述细胞破壁液中加入Zn²⁺，得到沉淀蛋白的步骤。

进一步地，在所述细胞破壁液中加入Zn²⁺后，在7000-9000rpm/min条件下离心5-15min，取沉淀得到所述沉淀蛋白。

进一步地，所述Zn²⁺的浓度为2-200mM，优选为10-50mM，进一步优选为20mM。

进一步地，所述复溶包括将经所述沉淀得到的沉淀蛋白用Tris缓冲液进行溶解，得到复溶溶液的步骤；

优选地，将经所述沉淀得到的沉淀蛋白用Tris缓冲液进行溶解后，在7000-9000rpm/min条件下离心5-15min，取上清得到所述复溶溶液。

进一步地，所述离子交换层析的层析步骤包括：用NaCl浓度为90-110mM的Tris缓冲液对结合有荧光蛋白的离子交换层析柱进行洗脱，洗脱得到的溶液为纯化的荧光蛋白；