[发明专利]一种改进的重叠延伸PCR方法

权利要求书

1.一种改进的重叠延伸PCR方法，其特征在于克隆单个目的基因片段到载体时，以pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP质粒为模板，用引物P1和引物P2进行第一轮PCR扩增，获得copGFP-WPRE片段，copGFP-WPRE片段核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；再以copGFP-WPRE片段与慢病毒载体LCas9载体作为模板，利用引物P1和引物P3进行第二轮PCR扩增，获得Cas9-copGFP融合产物，LCas9载体核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述引物P1的3’端与copGFP-WPRE片段有19bp的匹配序列，5’端与载体有19bp的匹配序列，P2的3’ 端与目的基因有14bp的匹配序列，5’ 端与载体有21bp的匹配序列；P3共25bp，全部与载体相互匹配，其中3’ 端与P1的5’ 端有19bp相匹配；

引物P1：GAGAAAGGTGGAGGCCAGCATGGAGAGCGACGAGAGCG；

引物P2：GTACCGGTACCGCGGCCGCGGAAGAGGCCGCAGAG；

引物P3：GCTGGCCTCCACCTTTCTCTTCTTC。

2.一种改进的重叠延伸PCR方法，其特征在于克隆两个目的基因片段到载体的同一位点时，以pKOD-Sso7d质粒为模板，以引物P1和引物P2进行第一轮PCR扩增，获得Sso7d DNA片段，pKOD-Sso7d质粒核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；以Rosetta（DE3）菌的基因组DNA为模板，以引物P3和引物P4进行第一轮PCR扩增，获得T7C565-883 DNA片段；将Sso7d DNA片段和T7C565-883 DNA片段与pLysS载体共同作为模板，利用引物P2和引物P3进行第二轮PCR扩增，获得Sso7d DNA片段和T7C565-883 DNA片段及载体pLysS的融合产物，pLysS载体核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

引物P1：

GCTAACGCAGTCAGGCACCAAGGAGAGATCTATGGGCGGCCGCGCAACCGTAAAGTTCA；

引物P2：CCTCCAGATCCACCACCGGATCCCTTTTTCTGCTTCTCCAGCA；

引物P3：GGATCCGGTGGTGGATCTGGAGGTTCAGAAACCGTTCAGGACATCTACG；

引物P4：AATTCGACCCGGTCGTCGACTTACGCGAACGCGAAGTCCGA。

3.一种改进的重叠延伸PCR方法，其特征在于克隆两个目的基因片段到载体的不同位点时，以pCR2.1质粒为模板，以引物P1和引物P2进行第一轮PCR扩增，获得Neo DNA片段；以Rosetta（DE3）菌的基因组DNA为模板，P3加上T7NF和引物P4进行第一轮PCR扩增，获得T7N1-564 DNA片段；以Neo DNA片段和T7N1-564 DNA片段与pKOD-Sso7d载体共同作为模板，利用两对引物P1和P3’、 P3和P1’再进行第二轮PCR扩增，获得Neo DNA片段和T7N1-564 DNA片段融合到pKOD-Sso7d载体的不同位点；

引物P1：GTTAAACAAAATTATTTCTAGTCAGGTACCGAAGAACTCGTCAAGAAGG；

引物P2：

GATAACAATTCCCCTCTAGAAGAAGGAGATATACCATGGGATCGGCCATTGAAC；

引物P3：

GGCACGTAAGAGGTTCCAACTTTCACCATAATGAAACACCATGGGGTACTAGAGAAAG；

引物P4：

CAATGCCAGCGCTTCGTTAGTCGACGTATCCGCGGCCGCTTGAACCTCCAGATCCACCACTAGGAAGCAAGTTAAC；

引物P1’： CCTGACTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGATCC；

引物P3’：

GTTGGAACCTCTTACGTGCCGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAG；

引物T7NF：

CCATGGGGTACTAGAGAAAGAGGAGAAAGATCTATGAACACGATTAACATCGCTAAG。