[发明专利]一种改进的重叠延伸PCR方法

说明书

本发明公开了一种改进的重叠延伸PCR方法，本发明通过添加引物，在重叠延伸PCR过程中能利用引物进行指数扩增，有效提高克隆效率和插入片段的长度，如实施例1所示，传统方法无法获得目的克隆，而本发明方法克隆数提高约10倍的同时阳性率为50％；能在载体同一位置同时插入多个片段；能在载体不同位置同时插入、删除及置换多个片段。

(一)技术领域

本发明涉及一种单位点及多位点插入、删除及置换的突变及大片段克隆方法。

(二)背景技术

经典的目的基因克隆方法依赖于限制性内切酶酶切以及连接酶连接，该方法需要载体和目的片段具有相应的酶切位点，因此目的基因的克隆位点受到酶切位点的限制。利用重叠延伸PCR能够将目的基因克隆到载体的任意位点，但该方法只能进行线性扩增，克隆效率随着克隆片段的增大而急剧下降，最大只能克隆6.7kb左右的片段到载体上。

传统的重叠延伸克隆方法如图1中A所示：该方法首先设计一对嵌合引物，引物的3’端与目的基因配对，引物的5’则与载体的克隆位点配对，用这对引物扩增目的基因片段后，目的基因片段上就有了能和载体配对的区域；接着把目的基因片段与载体混合后，经过变性、退火和延伸，此时目的基因片段与载体配对区域结合后能作为引物延伸，从而获得载体与目的基因片段融合的大片段，经过多轮循环；最后两条互补的融合大片段能够形成带有切刻的环状双链DNA，用DpnI限制性内切酶去除原始质粒后，转化可得含有目的基因的质粒。该方法的扩增是线性的，不是指数扩增，因此扩增效率不高，最大克隆片段大约是6.7kb。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种单位点及多位点插入、删除及置换的突变及大片段克隆方法，通过设计额外的引物，在重叠延伸PCR过程中加入引物，能够使载体和目的基因的延伸产物被指数扩增，再利用T4 DNA聚合酶等具有外切核酸酶活性的酶处理，可以有效提高大片段的克隆效率。本发明方法不仅可以进行单位点的DNA片段插入，删除和置换，也可以同时进行多片段在多位点的插入，删除和置换。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种改进的重叠延伸PCR方法，所述方法为下列之一：(1)当克隆单个目的基因片段至载体时：以待克隆目的基因为模板，设计两端分别与目的基因和载体有14bp及以上重叠的引物进行第一轮PCR扩增，以第一轮PCR产物和载体为模板，以一端与目的基因有14bp及以上重叠、另一端与载体有14bp及以上重叠的引物进行第二轮PCR扩增，获得目的基因和载体的融合产物；(2)当克隆两个及以上目的基因片段到载体的一个位点时，分别根据各个目的基因设计引物，第一个目的基因和最后一个目的基因的各自一条引物两端分别与载体和目的基因有14bp及以上重叠，相邻两个目的基因的一条引物间有14bp及以上重叠；(3)当克隆两个及以上目的基因片段到载体的不同位点时，每个目的基因片段引物的两端均与载体有14bp及以上重叠区域。