[发明专利]一种利用RNA位点特异性核酸酶的基因克隆方法

权利要求书

1.一种利用RNA位点特异性核酸酶的基因克隆方法，其特征在于，包括步骤为：(1)利用含有RNA碱基的引物PCR扩增目标基因和载体；(2)利用核酸酶HII或核酸酶HIII对步骤(1)得到的PCR扩增后的目标基因和载体进行消化处理，得到目标基因的单链DNA尾巴和载体的单链DNA尾巴；(3)将步骤(2)得到的目标基因的单链DNA尾巴和载体的单链DNA尾巴配对，形成带缺口的含有目标基因的重组载体；(4)步骤(3)得到的带缺口的含有目标基因的重组载体转化大肠杆菌后，所述含有目标基因的重组载体的缺口被修复好，得到含目标基因的完整重组载体。

2.根据权利要求1所述的基因克隆方法，其特征在于，步骤(1)中所述含有RNA碱基的引物的序列为：5’端第5-30位的碱基含间隔性的RNA碱基；扩增目标基因和载体的正向引物5’端的第1-30位碱基序列是互补配对的，扩增目标基因和载体的反向引物5’端的第1-30位碱基序列是互补配对的；3’端下游碱基序列与所述目标基因和载体的待扩增DNA片段两端碱基序列配对。

3.根据权利要求1所述的基因克隆方法，其特征在于，步骤(1)中所述扩增采用的是聚合酶链式反应PCR，扩增反应缓冲液中包括有用于扩增目标基因和载体的正向引物、用于扩增目标基因和载体的反向引物、目标核酸模板分子、DNA聚合酶、4种脱氧核苷三磷酸。

4.根据权利要求1所述的基因克隆方法，其特征在于，步骤(1)中还包括用限制性核酸内切酶DpnI对扩增后的目标基因和载体中的环状模板质粒进行消化去除。

5.根据权利要求1所述的基因克隆方法，其特征在于，步骤(2)中所述消化处理的温度根据核酸酶HII或核酸酶HIII的热稳定性确定，所述消化处理时间为0.5-10分钟。

6.根据权利要求1所述的基因克隆方法，其特征在于，步骤(2)中常温核酸酶HII或常温核酸酶HIII的消化处理温度为30-40度，热稳定性核酸酶HII或热稳定性核酸酶HIII的消化处理温度50-75度。

7.根据权利要求1所述的基因克隆方法，其特征在于，步骤(3)中所述配对过程是室温下放置0.5-15分钟。

8.根据权利要求1所述的基因克隆方法，其特征在于，所述利用RNA位点特异性核酸酶的基因克隆方法还包括对含目标基因的完整重组载体的鉴定：挑取单菌落，利用扩增目标基因的引物与Taq DNA聚合酶进行菌落PCR，鉴定含目标基因的完整重组载体的阳性克隆，培养阳性克隆，并抽提含目标基因的完整重组载体。

9.根据权利要求1所述的基因克隆方法，其特征在于，所述利用RNA位点特异性核酸酶的基因克隆方法用于基因点突变，包括步骤为：(1)利用含有RNA碱基的引物PCR扩增野生型基因的质粒载体，得到核苷酸突变型基因的质粒载体；(2)利用核酸酶HII或核酸酶HIII对步骤(1)得到的PCR扩增后的质粒载体进行消化处理，得到两端产生了彼此互补的单链尾巴的核苷酸突变型基因的质粒载体；(3)将步骤(2)得到的互补单链尾巴进行自我杂交配对，形成带缺口的含突变型目标基因的重组质粒载体；(4)步骤(3)得到的带缺口的含突变型目标基因的重组质粒载体转化大肠杆菌后，所述含突变型目标基因的重组质粒载体的缺口被修复好，得到含突变型目标基因的完整重组质粒载体。

10.根据权利要求9所述的基因克隆方法，其特征在于，步骤(1)中所述扩增采用的是聚合酶链式反应PCR，扩增反应缓冲液中包括有用于扩增的正向引物、用于扩增的反向引物、野生型质粒模板分子、DNA聚合酶、4种脱氧核苷三磷酸；步骤(1)中还包括用限制性核酸内切酶DpnI对扩增后的野生型基因的环状质粒模板进行消化去除；步骤(2)中所述消化处理的温度根据核酸酶HII或核酸酶HIII的热稳定性确定，所述消化处理时间为0.5-10分钟；步骤(2)中常温核酸酶HII或常温核酸酶HIII的消化处理温度为30-40度，热稳定性核酸酶HII或热稳定性核酸酶HIII的消化处理温度50-75度；步骤(3)中所述配对过程是室温下放置0.5-15分钟；所述利用RNA位点特异性核酸酶的基因克隆方法用于基因点突变还包括对含突变型目标基因的完整重组质粒载体的鉴定：挑取单菌落，培养阳性克隆，并抽提含突变型目标基因的完整重组质粒载体进行测序，验证点突变。