[发明专利]一种利用RNA位点特异性核酸酶的基因克隆方法

说明书

本发明公开了一种利用RNA位点特异性核酸酶的基因克隆方法，利用RNA嵌合引物，扩增载体与目标基因，然后将扩增片段用核酸酶HII与HIII进行消化，生成3’单链DNA，载体与目标基因的3’单链DNA彼此配对，形成带缺口重组质粒，转化大肠杆菌后缺口被修复完整，形成完好的环状重组质粒，进行基因克隆。通过上述方式，本发明不再依赖于限制性内切酶对载体和目标基因进行特异性切割，而且载体和目标基因之间的配对区长达10‑30个碱基，不再需要DNA连接酶对DNA进行连接缝合，可以直接转化大肠杆菌，极大地增加了一次基因克隆操作的目标基因数量，非常适合于高通量基因克隆，能应用于重组DNA的构建(基因克隆)、基因点突变等，也可用于精准医疗等领域的DNA文库构建。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种利用RNA位点特异性核酸酶的基因克隆方法。

背景技术

基因克隆技术的出现极大地促进了现代基因工程、蛋白质工程的发展。传统基因克隆技术涉及目标基因片段与质粒载体的限制性核酸内切酶消化、连接酶连接环化目标基因与质粒两步必不可少的操作。具体的克隆方法是通过限制性内切酶切割载体和目的片段，然后将载体和目的片段用连接酶连接起来。由于限制性核酸内切酶消化反应与DNA连接酶反应，特别是限制性核酸内切酶消化反应，效率的高低直接决定着目标基因克隆能否成功。虽然利用碱性磷酸单酯酶除去线性化载体的5’磷酸基团，会大大提高阳性克隆百分比，但该操作异常繁琐，手法难于掌握，经常起不到应有作用。该方法操作缺点主要有：1)需要在引物的5’端引入一个限制性内切酶切割位点，如果基因内部具有该位点则导致无法进行该基因的克隆；2)不同基因选择的内切酶不一样，需要不同的限制性内切酶进行处理，因此很难同时克隆多个基因。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种利用含RNA的引物和RNA位点特异性核酸酶进行的基因克隆方法，能解决现有基因克隆技术的不足，简化基因克隆操作，提高克隆效率与操作通量，可用于大规模基因克隆。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种利用RNA位点特异性核酸酶的基因克隆方法，包括步骤为：(1)利用含有RNA碱基的引物PCR扩增目标基因和载体；(2)利用核酸酶HII或核酸酶HIII对步骤(1)得到的PCR扩增后的目标基因和载体进行消化处理，得到目标基因的单链DNA尾巴和载体的单链DNA尾巴；(3)将步骤(2)得到的目标基因的单链DNA尾巴和载体的单链DNA尾巴配对，形成带缺口的含有目标基因的重组载体；(4)步骤(3)得到的带缺口的含有目标基因的重组载体转化大肠杆菌后，所述含有目标基因的重组载体的缺口被修复好，得到含目标基因的完整重组载体。

在本发明一个较佳实施例中，步骤(1)中所述含有RNA碱基的引物的序列为：5’端第5-30位的碱基含间隔性的RNA碱基；扩增目标基因和载体的正向引物5’端的第1-30位碱基序列是互补配对的，扩增目标基因和载体的反向引物5’端的第1-30位碱基序列是互补配对的；3’端下游碱基序列与所述目标基因和载体的待扩增DNA片段两端碱基序列配对。

在本发明一个较佳实施例中，步骤(1)中所述扩增采用的是聚合酶链式反应PCR，扩增反应缓冲液中包括有用于扩增目标基因和载体的正向引物、用于扩增目标基因和载体的反向引物、目标核酸模板分子、DNA聚合酶、4种脱氧核苷三磷酸。

在本发明一个较佳实施例中，步骤(1)中还包括用限制性核酸内切酶Dpn I对扩增后的目标基因和载体中的环状模板质粒进行消化去除。

在本发明一个较佳实施例中，步骤(2)中所述消化处理的温度根据核酸酶HII或核酸酶HIII的热稳定性确定，所述消化处理时间为0.5-10分钟。

在本发明一个较佳实施例中，步骤(2)中常温核酸酶HII或常温核酸酶HIII的消化处理温度为30-40度，热稳定性核酸酶HII或热稳定性核酸酶HIII的消化处理温度50-75度。

在本发明一个较佳实施例中，步骤(3)中所述配对过程是室温下放置0.5-15分钟。