[发明专利]一种鼠抗CD3重组免疫毒素及其制备方法和应用

说明书

本发明公开一种鼠抗CD3重组免疫毒素及其制备方法和应用，属于生物技术领域。本发明采用基因工程技术与策略，通过改变单链抗体与DT390的结合方式以提高其亲和力，优化密码子系列得到以DT结构为毒性中心的三种重组免疫毒素，构建其原核表达系统，得到靶向T细胞受体CD3ε的抗小鼠单链抗体偶联免疫毒素以剔除外周免疫器官的T淋巴细胞，利用其进行移植免疫模型建立，免疫耐受和自身性免疫疾病的等的治疗研究。证实靶向鼠抗CD3ε重组免疫毒素剔除鼠外周血及淋巴结T细胞的有效性。在小鼠T淋巴细胞剔除、自身性免疫疾病、器官移植、免疫耐受及肿瘤治疗的研究方面具有应用意义，后续可能有临床前药学研究及转化的潜能。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一类用于选择性破坏具有某一特异性标记细胞的融合蛋白，是将细胞选择性配体与毒素分子通过基因融合的方法组合而成的嵌合重组体及其制备方法和应用。

背景技术

免疫毒素(immunotoxin，IT)可作为一种靶向治疗药物，通常是将细胞选择性作用配体与毒素分子通过化学连接或基因融合的方法组合而成的嵌合体蛋白。作用机制由德国免疫学家Ehrilich在20世纪初提出。常用的靶向载体包括单克隆抗体如CD3、CDS、CD22、IL-2(白细胞介素2)、IL-3(白细胞介素3)GM-CSF(粒单集落刺激因子)和短肽激素等；毒素如蓖麻毒素(ricin)、假单胞菌外毒素(Pseudomonas Exotoxin，PE)、白喉毒素(diphtheriatoxin，DT)等。嵌合毒素的组成可以使单链的可变区片段免疫毒素(ScFvimmunotoxin)、双链的可变区片段免疫毒素(dsFv immunotoxin)和趋化因子或生长因子相关的免疫毒素等。嵌合毒素与野生型毒素相比具有稳定性强、渗透性好、较强的导向特异性，且制备时简洁稳定，可短期内大量复制。免疫毒素的毒性发挥部分还可以是小分子化合物毒素、放射性元素毒素和蛋白毒素(植物毒素和细菌毒素分子比较常见)。

DT是一种感染B棒状噬菌体的白喉杆菌的外毒素，完整的DT分子由535个氨基酸组成，分子量为58.4kD。根据其结构和功能特点，自N端向C端可分为3个结构区：催化区(C区)，由1～193氨基酸残基组成；跨膜区(T区)，由205～378氨基酸残基组成；受体结合区(R区)，由386～535氨基酸残基组成。R区能与真核细胞表面DT受体结合，T区在R区与受体结合后插入细胞膜中，使C区进入细胞内。C区含有ADP依赖的核糖体转移酶活性。能催化NAD⁺的ADP核糖基向延长因子EF-2转移，生成烟肽胺，使EF-2失活，阻断细胞蛋白质的合成。DT具有强烈的毒性，只需1个DT分子进入细胞内就可杀死1个真核细胞。利用DT分子的3个功能区在空间上相互独立的特点，可通过基因重组，将R区剔除，取而代之以特异性识别细胞表面受体分子的配体结构如上述生长因子、单克隆抗体等。