[发明专利]一种快速繁殖水曲柳胚性细胞的方法

说明书

本发明公开了一种快速繁殖水曲柳胚性细胞的方法，选取水曲柳愈伤组织，该愈伤组织来源可以是根、茎、叶、种子、胚等多种外植体，将愈伤组织接种在F4固体培养基中，培养1‑2个继代，可得水曲柳胚性愈伤组织；将松散的胚性愈伤组织接种到F4液体培养基中培养2‑3个继代，可以得到水曲柳单细胞和小细胞团。本发明的优点在于选择了F4培养基，该培养基除了常规的WPM基本培养基之外，选择30g/L的蔗糖和BA、NAA、IBA、TDZ四种激素组合，该培养基上的细胞涨势旺盛，只要在生长周期内继代就不会出现褐化死亡的现象。该方法的建立为水曲柳细胞规模化生产及次生代谢产物研究奠定基础。

技术领域

本发明涉及一种快速繁殖水曲柳胚性细胞的方法，属于细胞工程技术领域。

背景技术

水曲柳(Fraxinus mandschurica Rupr.)木犀科，白蜡树属，高大落叶乔木。基本特征是：树皮厚，灰褐色，冬芽大，圆锥形，小枝粗壮，四棱形，叶痕节状隆起，半圆形。羽状复叶；叶柄近基部膨大，叶着生处具关节，纸质，叶片长圆形至卵状长圆形，叶缘具细锯齿，上面暗绿色，下面黄绿色，圆锥花序生于去年生枝上，先叶开放，花序梗与分枝具窄翅状锐棱；雄花与两性花异株，均无花冠也无花萼；雄花序紧密，花梗细短，花药椭圆形，花丝甚短，子房扁而宽，翅果大而扁，自然生长环境下15年到20年才开花结果实，4月开花，8-9月结果。

水曲柳是我国东北素有“三大硬阔”之称的珍贵树木之一，木材材质优良，纹理美观，广泛应用于各领域。据调查发现，水曲柳是基本用种子繁殖的苗木，近几年也有一些扦插繁殖。目前，在水曲柳皮中检测出秦皮乙素、秦皮甲素、秦皮素、白蜡树精等物质，水曲柳皮在民间被用于治疗风湿、类风湿性关节炎及骨痛病，疗效确切。但树木去皮后就会死亡，砍伐也会造成资源的浪费和破坏，不利于可持续发展。因此，利用细胞工程技术快速培养水曲柳细胞是解决这一问题的方法之一，可以为工厂化生产及次生代谢产物研究提供条件。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速繁殖水曲柳胚性细胞的方法。该方法可以明显促进水曲柳胚性细胞的分化，单细胞的形成及小细胞团的繁殖，从而为水曲柳胚性细胞的培育及工业化生产，次生代谢产物提取提供重要的技术支持。

为了达到上述目的，本发明选取水曲柳的愈伤组织，该愈伤组织的诱导来源可以是根、茎、叶、种子、胚等多种外植体。将愈伤组织接入F4固体培养基中，经过1-2个继代的培养 (每个继代20天左右)，可以获得胚性愈伤组织，再选取松散的胚性愈伤组织进行扩繁就可以获得大量的胚性细胞。选取松散的胚性细胞接入F4液体培养基，经过2-3个继代的震荡培养(每个继代15天左右)，即可获得单细胞和小细胞团的混合细胞，经过细胞筛过滤就可分离单细胞和小细胞团。

一种快速繁殖水曲柳胚性细胞的方法，关键点在于选用F4培养基，该培养基既可以是固体培养基也可以是液体培养基。

一种快速繁殖水曲柳胚性细胞的技术方法所用的F4培养基，包括以下成分：

(1)F4固体培养基：包括基础培养基，激素，蔗糖，琼脂。