[发明专利]一种热稳定性提高的L-天冬氨酸-α-脱羧酶

说明书

本发明公开了一种热稳定性提高的L‑天冬氨酸‑α‑脱羧酶，属于基因工程技术领域。本发明通过对来源于赤拟谷盗的L‑天冬氨酸‑α‑脱羧酶进行定点突变，获得K49R，G369A和K221R三个酶突变体，将突变体重组质粒转化至大肠杆菌BL21中，表达分离纯化后，催化底物L‑天冬氨酸生成β‑丙氨酸。在50℃处理温度下，K49R可以使热稳定性相较于野生酶提高14％，G369A可以使热稳定性相较于野生酶提高20％，K221R可以使热稳定性相较于野生酶提高23％。其中，K221R还可以使比酶活达到约320U/g，相较于野生酶酶活提高了23％。这一发现对于工业化制备β‑丙氨酸具有重要的研究价值。

技术领域

本发明涉及一种热稳定性提高的L-天冬氨酸-α-脱羧酶，属于基因工程技术领域。

背景技术

L-天冬氨酸-α-脱羧酶(L-aspartate-a-decarboxylase，EC4.1.1.11，panD)催化L-天冬氨酸生成β-丙氨酸，是泛酸生物合成途径中重要的调控酶。

β-丙氨酸是自然界中唯一存在的β型氨基酸，它的用途十分广泛。工业上，β-丙氨酸是合成泛酸钙的重要原料，也是合成肌肽的两种氨基酸之一；医药上，β-丙氨酸可以作为原料用于合成抑制恶性肿瘤骨转移的帕米膦酸钠和抗结肠炎药物巴柳氮，同时还可作为铅中毒的解毒剂以及用于合成甜味剂等。

在工业生产中，β-丙氨酸的主要合成方式是丙烯酸、丙烯腈氨化法或β-氨基丙腈水解法，但是这些方法大多需要在高温、高压、强酸或强碱的条件下，而且产物纯化步骤繁琐，制备过程中会对环境造成污染。因此，寻找其他方法替代化学合成法制备β-丙氨酸是十分有必要的。

目前研究所发现的L-天冬氨酸-α-脱羧酶普遍存在酶活较低的问题，而且在工业生产中，需要酶具有较好的热稳定性，因此，提高L-天冬氨酸-α-脱羧酶的活性和热稳定性对于工业上合成β-丙氨酸具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种热稳定性提高的L-天冬氨酸-α-脱羧酶，所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶具有SEQ ID NO.2-4任一所示的氨基酸序列，或者，是在SEQ ID NO.1限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸得到的热稳定性提高的其他蛋白质。

本发明的第二个目的是提供编码上述L-天冬氨酸-α-脱羧酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6-8任一所示。

本发明的第三个目的是提供携带上述基因的载体、细胞、转化体。

本发明的第四个目的是提供制备上述L-天冬氨酸-α-脱羧酶的方法，根据SEQ IDNO.5所示的基因序列，设计定点突变引物，对基因进行定点突变，获得核苷酸序列如SEQ IDNO.6-8任一所示的基因，并在大肠杆菌中进行表达。

在本发明的一种实施方式中，利用上述方法得到的L-天冬氨酸-α-脱羧酶包括K49R、K221R、G369A，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，是以大肠杆菌(Escherichia coli)BL21为表达宿主。

在本发明的一种实施方式中，是以pET 28a(+)为表达载体。

在本发明的一种实施方式中，制备上述L-天冬氨酸-α-脱羧酶的方法的具体步骤包括：

(1)通过全质粒pcr得到核苷酸序列如SEQ ID NO.6，SEQ ID NO.7，SEQ ID NO.8所示的L-天冬氨酸α-脱羧酶基因与pET 28a(+)表达载体相连的质粒；

(2)将pcr产物经DpnI消化后，通过热激法转入大肠杆菌JM109中；