[发明专利]一种7β-羟基类固醇脱氢酶突变体、编码序列、重组表达载体、基因工程菌及应用

说明书

本发明提供了一种7β‑羟基类固醇脱氢酶突变体、编码序列、重组表达载体、基因工程菌及应用。对来源于产气柯林斯菌的7β‑羟基类固醇脱氢酶进行突变，获得的突变体Ca7β‑2的还原活力提高了7.6倍，还原氧化活力比值提高了4倍，在浓度为100mM的UDCA条件下孵育1小时，活力仅下降了8.4％；在30℃，pH8.0条件下催化合成UDCA和T‑UDCA，转化时间由24小时缩短到2小时，其中底物7‑KLCA的摩尔转化率为100％，底物T‑7‑KLCA摩尔转化率为99.5％。突变后的7β‑HSDH极大程度地降低了生产成本，提高了生产效率，更适合于工业化应用。

技术领域

本发明属于基因工程及酶工程领域，具体涉及一种7β-羟基类固醇脱氢酶突变体、编码序列、重组表达载体、基因工程菌及它们在制备熊去氧胆酸和牛磺熊去氧胆酸中的应用。

背景技术

熊去氧胆酸(UDCA)和牛磺熊去氧胆酸(T-UDCA)是名贵中药——“熊胆粉”的主要有效成分，目前已应用于治疗各种胆石疾病，各种急性、慢性肝病，具有明显的疗效。UDCA和T-UDCA传统的制备方法是从熊胆汁中提取，但这种方法提取过程困难、产物收率低、手段过于残忍，有违动物保护法。

当前，工业上生产UDCA和T-UDCA的方法除了“熊胆提取法”外，主要有化学合成法和酶法，其中化学合成法由于成本较高、工艺步骤多、“三废”严重和条件苛刻等缺点已逐步被淘汰；而酶法具有成本较低、工艺简单、绿色无污染及反应条件温和等优点，因此日益受到重视。

酶法生产UDCA或T-UDCA主要是利用7β-羟基类固醇脱氢酶 (7β-hydroxysteroiddehydrogenase，7β-HSDH，EC 1.1.1.201)催化7-酮石胆酸 (7-KLCA)和牛磺-7-酮石胆酸(T-7-KLCA)7位上的酮基加氢变成羟基，从而得到这2种重要的医用原料药。

野生型7β-羟基类固醇脱氢酶来源十分广泛，目前，国内外科研工作者已经筛选出众多产7β-羟基类固醇脱氢酶的微生物并将其编码基因克隆出来，如活泼瘤胃菌属(Ruminococcus gnavus)、扭链瘤胃球菌(Ruminococcus torques ATCC 35915)、产气柯林斯菌(Collinsella aerofaciens)、撒丁岛梭菌(Clostridium absonum)等。但是这些野生型菌株普遍存在活性偏低，受产物UDCA或T-UDCA 反馈抑制严重等缺点。

随着基因工程、蛋白工程、酶工程和生物信息技术的发展，许多科研工作者运用理性设计、半理性设计和定向进化等手段对野生型7β-羟基类固醇脱氢酶进行突变改造。如中国专利CN 105274070A中，刘志斌等对来源于活泼瘤胃菌属的7β-HSDH进行突变，其突变子RU-8C2和RU-4F9的活力由野生型的5.1U/ml 提高到9.5U/ml和16.6U/ml，其对应的氨基酸残基变化分别为T210N和 L3M/T219N。如中国专利CN 106636285 A中，傅荣昭等对来源于Turneriella parva 的野生型7β-HSDH进行突变，突变体V38R+V39R活力由254.8U/ml提高到 412.8U/ml，其反应温度由25℃提高到30℃，酶液投量和NADP+投量显著降低。 MingminZheng等(J.Agric.Food Chem.,2017,65(6),pp 1178–1185)对来源于 Ruminococcustorques ATCC 35915的7β-HSDH进行突变，他们采用易错PCR和 DNA重排的定向进化手段，其突变子V3-1由野生型的8.60μmol/min/mg提高到 51.4μmol/min/mg，比活由21.9U/mg提高到41.8U/mg，对应的氨基酸残基为 T189V/V207M。

虽然，国内外科研工作者利用基因工程及蛋白工程技术对7β-羟基类固醇脱氢酶进行突变改造，使其活性有了成倍的提高，但是，突变酶的活力依旧偏低、受产物抑制依旧很严重。因此，开发一种还原活力高、还原氧化活力比值高及产物抑制弱的酶具有重要意义。

发明内容