[发明专利]一种蝴蝶兰茎尖脱毒再生快繁的方法

权利要求书

1.一种蝴蝶兰茎尖脱毒再生快繁的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)第一次茎尖剥离：选取携带CyMV和ORSV复合感染的蝴蝶兰组培苗，洗净后切取带2-3片叶原基的茎尖分生组织，接种在脱毒培养基上进行第一次脱毒培养，获得一次脱毒茎尖；

所述脱毒培养基为：1/3MS+6-BA 0.2-1.0mg·L^-1+NAA 0.05-0.2mg·L^-1+蔗糖12-15g·L^-1+牛肉蛋白胨0.8-1g·L^-1+活性炭0.8-1.0g·L^-1；

2)第二次茎尖剥离：待步骤1)所获得的一次脱毒茎尖长出2-3片成熟小叶后，切取带2-3片叶原基的茎尖分生组织，接种在步骤1)所述的脱毒培养基上进行第二次脱毒培养，获得二次脱毒茎尖；

3)茎尖防褐化预处理：待步骤2)获得的二次脱毒茎尖长出成熟小叶后，切取带1-2片叶原基的茎尖组织接种到防褐化培养基上暗处理，防止褐化死亡；所述的防褐化培养基为：1/3MS+蔗糖12-15g·L^-1+牛肉蛋白胨0.8-1g·L^-1+椰汁150-200ml·L^-1+AC(活性炭)0.8-1.0g·L^-1；

4)病毒抑制剂结合交替变温预培养：将上述步骤3)中处理后的茎尖转接到添加病毒唑和氨基寡糖素的病毒抑制剂培养基上，同时结合交替变温热处理；所述的病毒抑制剂培养基为：1/3MS+6-BA0.2-1.0mg·L^-1+NAA0.05-0.2mg·L^-1+蔗糖12-15g·L^-1+牛肉蛋白胨0.8-1g·L^-1+椰汁150-200ml·L^-1+病毒唑45-50mg·L^-1+氨基寡糖素45-50mg·L^-1；

所述交替变温热处理为33℃培养4h，转而20℃培养6h，两种温度条件在培养期间循环交替进行，培养湿度50-60％，暗处理12-15天后，光照800-1000lux，光照培养时间30-40天；

5)茎尖再生培养：将经过上述步骤4)处理后的茎尖，转接到茎尖再生培养基中，获得茎尖再生组培苗；所述的茎尖再生培养基为：1/2MS+6-BA 0.2-1.0mg·L^-1+NAA 0.05-0.2mg·L^-1+蔗糖12-15g·L^-1+牛肉蛋白胨0.8-1g·L^-1+椰汁150-200ml·L^-1；

6)脱毒苗快速繁殖：将步骤5)获得的茎尖再生组培苗切去叶片和根部后接种于增殖培养基进行增殖培养，获得脱毒苗。

2.如权利要求1所述的蝴蝶兰茎尖脱毒再生快繁的方法，其特征在于，所述步骤1)中的第一次脱毒培养的培养条件为温度25-28℃，湿度50-60％，暗处理5-7天后，再光照800-1000lux，光照培养时间30-40天。

3.如权利要求1所述的蝴蝶兰茎尖脱毒再生快繁的方法，其特征在于，所述步骤2)中的第二次脱毒培养的培养条件为温度25-28℃，湿度50-60％，暗处理5-7天后，再光照800-1000lux，光照培养时间30-40天。

4.如权利要求1所述的蝴蝶兰茎尖脱毒再生快繁的方法，其特征在于，所述的步骤3)中的茎尖防褐化预处理的培养条件为温度25-28℃，湿度50-60％，暗处理培养10-15天。

5.如权利要求1所述的蝴蝶兰茎尖脱毒再生快繁的方法，其特征在于，所述步骤5)中的茎尖再生培养的培养条件为：温度25-28℃，湿度50-60％，光照800-1000lux，培养时间30-40天。