[发明专利]一种蝴蝶兰茎尖脱毒再生快繁的方法

说明书

本发明公开了一种蝴蝶兰茎尖脱毒再生快繁的方法，该方法同时结合多次茎尖剥离技术、防褐化处理、病毒抑制剂处理以及交替变温热处理技术，有效降低组培苗毒素含量，提高茎尖成活率。多次茎尖剥离技术能够防止植株其他部分的病毒向茎尖分生组织蔓延，其中切取带有叶原基的茎尖组织，可以在有效减少毒素在茎尖中含量的同时提高组培苗的成活率；茎尖预处理过程可以显著降低茎尖褐化死亡率，提高茎尖成活率，与此同时病毒抑制剂结合交替变温处理，能够有效脱出CyMV和ORSV病毒。

技术领域

本发明涉及一种蝴蝶兰茎尖脱毒再生快繁的方法，属于花卉组培技术领域。

背景技术

蝴蝶兰(Phalaenapsis)又称蝶兰，属兰科，蝴蝶兰属，因其花形美丽、花色艳丽、花期长而深受消费者青睐，素有“花中皇后”的美称。近年来，国际市场花卉产业发展迅速，蝴蝶兰市场更是蓬勃发展，已成为我国现代乡村振兴花卉产业优质高效的主流品种之一，经济前景非常广阔。

随着蝴蝶兰种苗组培快速繁殖以及国际贸易日趋频繁，兰花病毒病成为阻碍蝴蝶兰产业发展的技术瓶颈。由于病毒可通过日常管理操作中的机械性伤口、媒介昆虫进行传播，而蝴蝶兰商品苗主要采用组织培养方式快繁，若感染病毒，很容易快速蔓延造成严重损失。迄今，在蝴蝶兰上分离到的病毒超过25种，其中危害最重、分布最广的是建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus，CymMV)和齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus，ORSV)。当这两种病毒复合感染时，会加重病症，严重的影响兰花的观赏价值和经济价值。

迄今为止，获得无毒苗的主要途径包括茎尖剥离、热处理和病毒抑制剂等方法(刘黎卿等，2010)。其中，茎尖培养应用最广，但其脱毒效果常受茎尖大小的，茎尖褐化死亡率高及培养条件的影响，难以取得较高的存活率和脱毒率(靖晶，2011)。热处理方法主要是依据高温可抑制病毒的复制和运动蛋白的合成，造成病毒钝化失活，从而切取幼嫩尖端组织进行脱毒培养。然而研究表明CymMV和ORSV都具有一定的耐热性，其中CymMV的失毒温度为60～70℃，ORSV的失毒温度为92～94℃，因此单纯热处理对兰花脱除CymMV和ORSV效果不明显(郑国华等，2007)，并且长时间的高温处理也会降低兰花的成活率。而病毒抑制剂方法是采用抑制剂如孔雀绿、病毒唑和氨基寡糖素等，通过干扰病毒在植物体内的复制来达到防治病毒病的目的。病毒抑制剂的浓度是脱毒的关键，浓度太大茎尖死亡，浓度小无法脱毒。

发明内容

为了克服了上述现有技术的不足，本发明提供一种蝴蝶兰茎尖脱毒再生快繁的方法，包括多次茎尖剥离处理、茎尖防褐化预处理、病毒抑制剂结合交替变温处理预培养，茎尖再生培养及快速繁殖等，能够大大提高茎尖成活率和脱毒率，为蝴蝶兰脱毒种苗生产提供技术支撑。

一种蝴蝶兰茎尖脱毒再生快繁的方法，包括如下步骤：

1)第一次茎尖剥离：选取携带CyMV和ORSV复合感染的蝴蝶兰组培苗，洗净后切取带2-3片叶原基的茎尖分生组织，接种在脱毒培养基上进行第一次脱毒培养，获得一次脱毒茎尖；

所述脱毒培养基为：1/3MS+6-BA 0.2-1.0mg·L^-1+NAA 0.05-0.2mg·L^-1+蔗糖12-15g·L^-1+牛肉蛋白胨0.8-1g·L^-1+AC(活性炭)0.8-1.0g·L^-1；

2)第二次茎尖剥离：待步骤1)所获得的一次脱毒茎尖长出2-3片成熟小叶后，切取带2-3片叶原基的茎尖分生组织，接种在步骤1)所述的脱毒培养基上进行第二次脱毒培养，获得二次脱毒茎尖；

3)茎尖防褐化预处理：待步骤2)获得的二次脱毒茎尖长出成熟小叶后，切取带1-2片叶原基的茎尖组织接种到防褐化培养基上暗处理，防止褐化死亡；