[发明专利]一种云芝木糖苷转移酶的分离及应用

说明书

本发明公开了一种云芝木糖苷转移酶的分离及应用，对云芝基因组利用antismash软件进行产物分析以及糖苷转移酶同源分析，筛选潜在的目的基因；利用转录组测序分析，进一步对目的木糖苷转移酶基因进行定位；木糖苷转移酶基因的克隆、表达、分离和纯化；木糖苷转移酶功能活性鉴定。本发明的有益效果是充分利用转录组和代谢组学体系对真菌产物进行了基因定位，表达并鉴定了一种木糖苷转移酶，并对相关的酶学性质和应用进行了充分的研究。

技术领域

本发明属于真菌酶学活性技术领域，涉及一种云芝木糖苷转移酶的分离及应用。

背景技术

担子菌多孔菌科能够产生各种高药用价值的次级代谢产物，其中糖苷化合物(glycosides)因具有丰富的结构多样性和显著的抗氧化、抗肿瘤、免疫等生物学活性成为近年研究热点。申请者在研究多孔菌科真菌云芝和树舌灵芝的共培养体系产物潜能，发现云芝能产生以木糖(xylose)为糖体的一系列新颖木糖苷衍生物，特别是鉴定到一个云芝来源的以PKS化合物苔色酸氨基衍生物作为糖苷配基的双木糖基衍生物C18H25NO11(图1)，具有显著抑制酵母、新型隐球菌、革兰氏阳性细菌的活性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种云芝木糖苷转移酶的分离及应用，本发明的有益效果是充分利用转录组和代谢组学体系对真菌产物进行了基因定位，表达并鉴定了一种木糖苷转移酶，并对相关的酶学性质和应用进行了充分的研究。

本发明所采用的技术方案是按照以下步骤进行：

步骤1，对云芝基因组利用antismash软件进行产物分析以及糖苷转移酶同源分析，筛选潜在的目的基因；

步骤2，利用转录组测序分析，进一步对目的木糖苷转移酶基因进行定位；

步骤3，木糖苷转移酶基因的克隆、表达、分离和纯化；

步骤4，木糖苷转移酶功能活性鉴定。

进一步，步骤1：对已测序的云芝基因组，利用生物信息学软件进行基因组扫描与预测分析，用antismash软件进行次级代谢产物基因簇的预测分析，找到与目标产物合成相关的基因簇，接着利用糖苷转移酶的同源序列比对相似度分析，对基因组内存在的与糖基转移相关的候选基因。

进一步，步骤2：选取单独液体培养的云芝菌丝球和共培养后分离的云芝菌丝球作为实验样本，分别进行转录组测序分析，分析转录组峰差异表达的基因，并进一步针对这些基因进行富集GO分析和KEGG代谢通路分析，进一步定位合成糖基转移酶相关的基因。结合步骤1的预测分析，最终确定目的合成基因。

进一步，步骤3：提取云芝基因组，利用cDNA进行目的基因的PCR克隆，利用pET表达性质粒在E.coli(DE3)宿主中构建表达木糖基转移酶的重组菌株，IPTG诱导、纯化木糖基转移酶，构建体外木糖基转移酶检测系统，利用LC-MS检测产物的生成和底物消耗，测定转移酶对不同底物(苔色酸、苯乳酸、UDP-葡萄糖等)的Km和Kcat值。

进一步，步骤4：建立木糖基转移酶的同源建模和分子对接：通过PDB数据库，搜索结构相近的蛋白质作为建模模板，利用同源建模软件(Modeller)构建并优化目标蛋白整个结构模型，并对模型进行质量检测与评估；利用Autodock将各种底物与木糖基转移酶对接，通过ZINC数据库获取底物配体结构文件，选择对接靶点和合适的对接参数，分析对接结果。

附图说明

图1是化合物结构图；

图2是云芝新颖糖苷化合物的基因簇鉴定及其苔色酸的结构域组成及生物合成分析；

图3是单培养与共培养模式下云芝差异表达基因聚类图；

图4是差异基因GO分析和KEGG分析。

具体实施方式