[发明专利]一种分离自桑椹白化病果新病原的鉴定及致病性检测方法

权利要求书

1.一种分离自桑椹白化病果新病原的鉴定及致病性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、病原菌的分离

在无菌操作环境下，将桑椹病果用无菌水冲洗干净，滤纸吸干水分后，置于75％的酒精中浸泡几秒钟，在酒精灯火焰上灼烧一下，之后使用无菌刀片划开病果，将其切成小块，用无菌镊子取病果中间的小块置于PDA培养基上，每个培养基上放置4-5块,25℃恒温培养箱中暗培养；待菌落长出后根据菌落特征，采用顶端菌丝挑取法进行纯化，并将纯化的单一菌株移入PDA斜面培养基，4℃保藏备用；

步骤2、致病性检测

2.1实验室活体叶片接种将PDA平板上28℃培养7天的菌株打取直径6mm的菌饼，接种到3-5叶期活体幼苗的叶片上，每棵幼苗接种3个菌饼，28℃恒温培养箱暗培养两天后，去除菌饼，置于光照培养箱中继续培养并观察记录叶片的发病情况；以接种PDA的活体幼苗为空白对照,每个处理重复3次；对接种发病的幼苗，取病健交界组织，用1％的次氯酸钠溶液浸泡5min，70％的乙醇处理20s，无菌水清洗数次后置于PDA平板上，28℃培养7天，观察再次分离的菌株与原接种菌株的差异；

2.2田间桑椹接种在五月下旬桑果成熟之际，将待测菌株打取直径6mm的菌饼，接种在选定的正常桑椹上，并用保鲜膜轻轻缠绕固定，再进行套袋处理，减少其他因素的影响；每棵桑树接种3个菌饼，接种两天后去除菌饼，观察并记录桑椹的发病情况；以接种PDA的正常桑椹为空白对照,每个处理重复3次；对接种发病的桑椹，同上述实验室活体叶片接种的方法进行再分离；

步骤3、分离菌株的鉴定

3.1形态学鉴定将保存的菌株Z4转接于PDA培养基上复苏活化后，用打孔器打取直径6mm的菌饼接入新的PDA培养基上,28℃培养，每天观察并记录纯化菌株的菌落形态、颜色及生长情况，并使用光学显微镜观察其大、小分生孢子的显微形态特征，根据真菌分类系统初步进行种类鉴定；

3.2分子生物学鉴定采用CTAB法提取菌株基因组DNA，以其为模板，分别用真菌EF-1ɑ：EF-1H：5'-ATGGGTAAGGAAGACAAGAC-3'，EF-2T：

5'-GGAAGTACCAGTGATCATGTT-3'和ITS：ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'基因通用引物进行PCR扩增；扩增体系为25μl，其中模板DNA1μl，上下引物各1μl，ddH₂O10μl，Taq Mix12μl；扩增程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，34个循环；72℃延伸5min；扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序；获得的EF-1ɑ序列和ITS序列分别在GenBank数据库中进行数据库比较，下载同源性较高的序列，利用MEGA5.0软件，使用NJ法进行1000次步长计算，构建系统发育树，确定菌株的分类地位。

2.根据权利要求1所述的分离自桑椹白化病果新病原的鉴定及致病性检测方法，其特征在于，所述马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基为：马铃薯浸粉3克，葡萄糖20克，琼脂14克，蒸馏水1升；所述合成低营养琼脂SNA培养基为：磷酸二氢钾1克，硝酸钾0.5克，葡萄糖0.2克，蔗糖0.2克，琼脂15克，蒸馏水1升。