[发明专利]一种分离自桑椹白化病果新病原的鉴定及致病性检测方法

说明书

本发明公开了一种分离自桑椹白化病果新病原的鉴定及致病性检测方法，包括以下步骤：步骤1、病原菌的分离；步骤2、致病性检测；步骤3、分离菌株的鉴定。本发明将传统的形态学观察与现代分子生物学技术相结合，对桑椹白化病的病原菌进行了鉴定，为丰富桑椹白化病的病原菌库，探寻桑椹白化病的发病原因和规律奠定理论基础，同时也为桑椹白化病的防治提供科学依据，以期在实践生产中减少桑椹白化病带来的损失。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种分离自桑椹白化病果新病原的鉴定及致病性检测方法。

背景技术

桑椹，市面上常见的一种水果，酸甜可口，深受消费者的青睐。桑椹不仅富含营养物质，还具有多种防病保健功效，因此，1993年卫生部将其列为“既是食品又是药品”的农产品之一^[1]。然而，桑椹在成熟过程中易被病原菌侵染致病，其中桑椹白化病是常见病害之一。近几年来，在我国江苏、浙江、四川、山东、山西、广东、广西和台湾等地都已发生过桑椹白化病，该病危害性大，且具有传染性，会严重破坏桑果产量及品质，防治不及时可导致果桑大面积减产甚至绝收，给农民造成了巨大的经济损失。

层出镰刀菌是一种常见的动、植物病原菌，该菌最早是由(Matsushima)Nirenberg1976年首先分离得到并定名的。因其具有广泛的地域分布及寄主范围，是生产上最难防治的重要病害之一。近年来,由层出镰刀菌侵染的作物新病害有上升趋势,如番茄叶斑病、番茄枯萎病、大蒜干腐病、小麦枯萎病、小麦根腐病、烟草叶斑病、烟草根腐病、燕麦枯萎病、红藻枯萎病、芦荟叶斑病、香蕉果腐病、茄子花腐病、地黄根腐病、百合枯萎病、芒果畸形病、苜蓿根腐病、洋葱干腐病、水稻穗腐病、国槐根茎腐烂病、苹果再植病、甘蔗梢腐病、玉米鞘腐病、玉米穗腐病等逐渐成为生产中不可忽视的问题。但目前还未有层出镰刀菌感染桑椹致其发生白化病的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分离自桑椹白化病果新病原的鉴定及致病性检测方法。将传统的形态学观察与现代分子生物学技术相结合，对桑椹白化病的病原菌进行了鉴定，为丰富桑椹白化病的病原菌库，探寻桑椹白化病的发病原因和规律奠定理论基础，同时也为桑椹白化病的防治提供科学依据，以期在实践生产中减少桑椹白化病带来的损失。

其具体技术方案为：

一种分离自桑椹白化病果新病原的鉴定及致病性检测方法，包括以下步骤：

步骤1、病原菌的分离

在无菌操作环境下，将桑椹病果用无菌水冲洗干净，滤纸吸干水分后，置于75％的酒精中浸泡几秒钟，在酒精灯火焰上灼烧一下，之后使用无菌刀片划开病果，将其切成小块，用无菌镊子取病果中间的小块置于PDA培养基上，每个培养基上放置4-5块,25℃恒温培养箱中暗培养。待菌落长出后根据菌落特征，采用顶端菌丝挑取法进行纯化，并将纯化的单一菌株移入PDA斜面培养基，4℃保藏备用。

步骤2、致病性检测

2.1实验室活体叶片接种 将PDA平板上28℃培养7天的菌株打取直径6mm的菌饼，接种到3-5叶期活体幼苗的叶片上，每棵幼苗接种3个菌饼，28℃恒温培养箱暗培养两天后，去除菌饼，置于光照培养箱中继续培养并观察记录叶片的发病情况。以接种PDA的活体幼苗为空白对照,每个处理重复3次。对接种发病的幼苗，取病健交界组织，用1％的次氯酸钠溶液浸泡5min，70％的乙醇处理20s，无菌水清洗数次后置于PDA平板上，28℃培养7天，观察再次分离的菌株与原接种菌株的差异。

2.2田间桑椹接种 在五月下旬桑果成熟之际，将待测菌株打取直径6mm的菌饼，接种在选定的正常桑椹上，并用保鲜膜轻轻缠绕固定，再进行套袋处理，减少其他因素的影响。每棵桑树接种3个菌饼，接种两天后去除菌饼，观察并记录桑椹的发病情况。以接种PDA的正常桑椹为空白对照,每个处理重复3次。对接种发病的桑椹，同上述实验室活体叶片接种的方法进行再分离。

步骤3、分离菌株的鉴定