[发明专利]以三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯整体柱为基质的固定化酶反应器

权利要求书

1.一种以三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯整体柱为基质的固定化酶反应器的制备方法，其特征在于经过如下步骤：

1）制备三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯有机整体柱：将基质为三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯 200 μL，异辛烷680 μL和甲苯120 μL作为致孔剂，偶氮二异丁腈3.6 mg为引发剂，混合超声，150 W,10 min；形成预聚合液注入已处理好的毛细管中，用胶塞封住毛细管两端，置于50℃水浴锅内，反应24 h后取出毛细管，用乙腈冲洗除去未反应的溶液及引发剂，得到三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯整体柱；

2）胰蛋白酶二硫键的还原：用20 mM pH 8.0的Tris-HCl缓冲液配制浓度分别为10 mg/mL胰蛋白酶溶液和浓度为1 mg/mL三(2-羰基乙基)磷盐酸盐溶液，然后按TCEP：胰蛋白酶溶液体积比例为1:10的混合两种溶液，混合溶液在25℃反应3 h使胰蛋白酶中双硫键还原断裂，然后混合液在4℃以10000 rpm转速离心10 min除去不溶物；待得到的溶液温度恢复到室温后，加入过硫酸铵使其浓度为1 mg/mL；向上述溶液中加入N,N'-亚甲基双丙烯酰胺使其浓度为2 mg/mL，震荡使其充分溶解，制备好的溶液即为酶衍生液；

3）胰蛋白酶的固定：在酶固定化之前，先将三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯有机整体柱用氮气吹干，然后将上述酶衍生液注入到整体柱中，长度为10 cm；注入酶衍生液的整体柱在25℃反应5 h以充分固定，待反应完成后，酶柱用20 mMpH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗1 h除去未反应的物质；酶柱保存于4℃冰箱备用。

2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤1) 所述的整体柱的制备中偶氮二异丁腈在甲苯和异辛烷中超声溶解后，再加入三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯超声5min形成预聚合液。

3.权利要求1-2所述制备方法制备的固定化酶反应器。

4.权利要求3所述的固定化酶反应器在酶解蛋白质样品中的应用。