[发明专利]以三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯整体柱为基质的固定化酶反应器

说明书

本发明涉及一种以三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯整体柱为基质的固定化酶反应器。以具有三个双键的三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯（TRIM）、甲苯、异辛烷、偶氮二异丁腈来制备骨架材料作为胰蛋白酶的固定基质，TRIM骨架表面有剩余的双键存在，能够在常温下与胰蛋白酶表面的自由巯基发生点击反应而将酶键合在整体柱上。本发明制备的酶反应器无需在固定基质上引入功能基，制备更简便；也避免了胰蛋白酶功能化，防止了酶变性失活。本研究为人们研究酶反应器的固定基质提供了一种新思路，所制备的酶反应器可用于蛋白质的高效快速酶解。

技术领域

本发明涉及一种以三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯整体柱为基质的固定化酶反应器，通过“巯基-烯”点击反应制备以三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯（TRIM）有机整体柱为基质的固定化酶反应器，属于酶反应器技术领域，旨在研究一种新型的酶固定基质，制备的酶反应器用于蛋白质样品的高效、快速酶解。

背景技术

将蛋白水解为肽段是“自下而上”蛋白组学研究的关键步骤。然而，常规溶液酶解具有耗时长、活性低、蛋白酶自溶解、蛋白酶不可重复使用等缺点，因此将酶固定化是一种有效方法解决上述问题。酶固定化有以下优点：缩短酶解时间；提高酶活性；固定化酶可以重复利用，降低实验成本；能减少蛋白酶自溶解对后续质谱检测的干扰等。

整体材料因其制备简便、比表面积大、通透性好、传质速度快等优点，成为酶固定非常好的材料基质。无机整体柱制备复杂、重现性差。相比之下，有机整体柱具有良好的孔隙率、生物相容性和稳定性，而被广泛应用。目前固定酶的主要方法有Staudinger反应、叠氮-炔点击反应、“巯基-烯”点击反应等。然而大多数方法需要在固定基质或蛋白酶上额外引入活性功能基，导致操作繁琐或使蛋白酶变性失活。“巯基-烯”点击反应可以在温和条件下快速进行，且对介质中的水和空气不敏感，不会使蛋白酶变性失活。传统的有机整体柱无残余双键存在，需额外引入双键才能发生反应。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的以三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯整体柱为基质的固定化酶反应器。本发明基于TRIM骨架表面有剩余的双键存在，能够在常温下与胰蛋白酶表面的自由巯基发生点击反应而将酶键合在整体柱上。通过巯基桥联反应将胰蛋白酶固定在TRIM有机基质上，无需在固定基质上引入功能基，制备更简便；也避免了胰蛋白酶功能化，防止了酶变性失活。本发明提供了一种新思路，所制备的酶反应器不仅可以高效快速酶解蛋白，还具有良好稳定性，可重复使用。

本发明提供的以三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯整体柱为基质的固定化酶反应器是将偶氮二异丁腈、甲苯、异辛烷、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯（TRIM）按适当比例混合超声后形成预聚合液注入已处理好的毛细管中，用胶塞封住毛细管两端，置于水浴锅内反应一段时间。胰蛋白酶的固定化是通过“巯基-烯”点击反应实现。通过N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐（BAEE）向N-苯甲酰-L-精氨酸（BA）的转化率及牛血清白蛋白（BSA）和细胞色素（Cyt-C）的蛋白质消化率来表征酶反应器的性能。

本发明提供的以三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯整体柱为基质的固定化酶反应器是按下述具体方法步骤制备：

1）有机整体柱的制备：TRIM 200 μL，异辛烷680 μL和甲苯120 μL作为致孔剂，偶氮二异丁腈3.6 mg为引发剂，混合超声后形成预聚合液注入已处理好的毛细管中，用胶塞封住毛细管两端，置于50℃水浴锅内，反24h后取出毛细管，用乙腈冲洗除去未反应的溶液及引发剂。

2）胰蛋白酶二硫键的还原：在pH 8.0的Tris-HCl缓冲液中分别配制浓度为10 mg/mL胰蛋白酶溶液和浓度为1 mg/mL三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)溶液；然后按TCEP：胰蛋白酶溶液比例为1:10（v/v）混合两种溶液，混合溶液在25ºC反应3 h，使胰蛋白酶中双硫键还原断裂；然后混合液在4ºC以10000 rpm转速离心10 min除去不溶物；待得到的溶液温度恢复到室温后，加入过硫酸铵使其浓度为1 mg/mL；向上述溶液中加入N,N'-亚甲基双丙烯酰胺（BAA）使其浓度为2 mg/mL，震荡使其充分溶解，制备好的溶液即为酶衍生液。