[发明专利]一种捕获特定微量细胞的装置及其制作和使用方法

权利要求书

1.一种捕获特定微量细胞的装置，其特征在于，包括磁珠、连接核酸和含多拷贝适配体的长链核酸；所述连接核酸一端固定在磁珠表面，另一端以碱基互补的形式连接含多拷贝适配体的长链核酸；

所述连接核酸由天然或化学修饰的核苷酸组成，所述含多拷贝适配体的长链核酸是由多个单价核酸适配体和与连接核酸互补的间隔序列组成的单链核酸；

所述连接核酸的长度为10~200个核苷酸单元，所述连接核酸与含多拷贝适配体的长链核酸序列中部分序列互补配对；所述连接核酸是多个重复的A或者T序列，或者是其他与含多拷贝适配体的长链核酸序列中的部分序列互补配对的核酸序列；所述含多拷贝适配体的长链核酸的长度为200~300000个核苷酸单元，间隔序列为3~40个核苷酸单元的重复T或者A序列，且与连接核酸互补；

所述磁珠通过生物素-亲和素或生物素-链霉亲和素结合方式将连接核酸固定在磁珠表面。

2.根据权利要求1所述的捕获特定微量细胞的装置，其特征在于，所述磁珠的粒径为0.1~25 μm，所述磁珠的表面包被生物素或者亲和素或链霉亲和素。

3.根据权利要求1所述的捕获特定微量细胞的装置，其特征在于，所述连接核酸的3’或者5’端修饰生物素或亲和素或者链霉亲和素。

4.根据权利要求1所述的捕获特定微量细胞的装置，其特征在于，所述含多拷贝适配体的长链核酸的合成方法采用聚合酶链式反应或核酸等温扩增技术。

5.一种如权利要求1至4任一项所述的捕获特定微量细胞的装置的制作方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将链霉亲和素或亲和素或生物素标记的磁珠洗涤、离心，重悬于PBS中；

2）与1）相对应结合的生物素或链霉亲和素或亲和素标记的连接核酸用PBS配成母液；

3）取磁珠和连接核酸，混匀，室温在摇床上反应1~3h;

4）将上述反应产物置于磁力架上，室温下，磁性分离处理5~30 min，缓慢去除其中的液体，剩余的即为磁珠-连接核酸复合物；

5）将含多拷贝适配体的长链核酸与上述步骤4）中的复合物混合于PBS中，室温在摇床上反应1~3 h；

6）将5）中的反应产物置于磁力架上，室温处理5~30 min，缓慢吸取去除其中的液体，剩余的即为所述的捕获特定微量细胞的装置。

6.根据权利要求5所述的捕获特定微量细胞的装置的制作方法，其特征在于，所述步骤3）中磁珠和连接核酸的物质的量比为1:20~10¹⁰；所述步骤5）中磁珠-连接核酸复合物和含多拷贝适配体的长链核酸的物质的量比为1:2~10⁶。

7.一种利用权利要求1至4任一项所述的捕获特定微量细胞的装置进行捕获细胞的方法，该方法为非疾病的诊断和治疗目的，其特征在于，所述方法为直接法或间接法，所述直接法包含以下步骤：

1）将链霉亲和素或亲和素或生物素标记的1~25 μm磁珠洗涤、离心，重悬于PBS中；

2）与上述1）相应的生物素或链霉亲和素或亲和素标记的连接核酸用PBS配成母液；

3）取磁珠和连接核酸，混匀，室温在摇床上反应1~3 h；所述的磁珠和连接核酸的物质的量比为1:20~10¹⁰；

4）将上述反应产物置于磁力架上，室温处理5~30 min，缓慢吸取液体，剩余的即为磁珠-连接核酸复合物；

5）将含多拷贝适配体的长链核酸与上述步骤4）中的磁珠-连接核酸复合物混合于PBS中，室温在摇床上反应1~3 h；所述磁珠-连接核酸复合物和含多拷贝适配体的长链核酸的物质的量比为1:2~10⁶；

6）将细胞混匀于PBS中，将步骤5）中的混合后的复合物重悬于PBS中形成溶液，4~25 °C下在摇床上反应10~60 min；

7）将上述6）得到反应物在磁力架上放置5~30 min，缓慢吸取液体，并用PBS清洗2次，此时获得捕获的细胞；

所述间接法包含以下步骤：

1）将链霉亲和素或亲和素或生物素标记的0.1~1 μm磁珠洗涤、离心，重悬于PBS中；

2）与1）相应的生物素或者链霉亲和素或亲和素标记的连接核酸用1×PBS配成母液；

3）取磁珠和连接核酸，混匀，室温在摇床上反应1~3 h；所述的磁珠和连接核酸的物质的量比为1:20~10¹⁰；

4）将上述反应产物置于磁力架上，室温处理5~30 min，缓慢吸取液体，剩余的即为磁珠-连接核酸复合物；该复合物重新悬浮于PBS缓冲液中；

5）将含多拷贝适配体的长链核酸与细胞混悬液混合，在4~25 °C下摇床反应10~30min，离心，去除上清，并重新悬浮于适量PBS缓冲液中，形成待分离靶细胞-长链核酸复合物；所述待分离靶细胞和含多拷贝适配体的长链核酸的个数比为1：10³~10²⁰；

6）将步骤5）中的混合液与上述步骤4）中的复合物混合，4~25 °C下在摇床上反应1~3h；所述磁珠-连接核酸复合物和细胞-含多拷贝适配体的长链核酸复合物的个数比为2~10⁵：1，得到反应产物置于磁力架上，室温处理5~30 min，缓慢吸取液体，剩余的即为磁珠-细胞复合物。