[发明专利]一种微卫星生物标志物组合、检测试剂盒及其用途

说明书

本发明涉及生物标志物组合，检测其的试剂盒，及其在血浆样本中的微卫星不稳定(MSI)检测和癌症，优选结直肠癌(例如肠癌)、胃癌或子宫内膜癌的无创诊断，预后评估，治疗方案的选择或遗传筛查中的用途。本申请首次提供了血浆MSI检测方法，可以以高准确度高灵敏度判断样本的微卫星(MS)状态。

发明领域

本发明涉及生物标志物组合，检测其的试剂盒，及其在血浆样本中的微卫星稳定状态检测和癌症，优选结直肠癌(例如肠癌)、胃癌或子宫内膜癌的无创诊断，预后评估，治疗方案的选择或遗传筛查中的用途。

发明背景

微卫星是基因上含有的重复DNA短小序列或单核苷酸区域。在肿瘤细胞中，当DNA发生甲基化或基因突变致错配修复基因缺失时,可导致微卫星重复序列错配(微卫星突变)，导致其序列缩短或延长，从而引起微卫星不稳定(microsatellite instability，MSI)。根据MSI不稳定的程度，可分为微卫星高度不稳定(microsatellite instability-high,MSI-H)，微卫星低度不稳定(microsatellite instability-low,MSI-L)，和微卫星稳定(microsatellite stable，MSS)型。

大量研究表明，MSI参与恶性肿瘤的发生发展过程，与结直肠癌(例如肠癌)、胃癌、子宫内膜癌等发生密切相关。例如，约15％的结直肠癌患者存在MSI-H现象，其中典型的遗传性非息肉病性结直肠癌(hereditary nonpolyposis colerectal cancer,HNPCC)患者90％以上存在MSI-H，表明MSI-H可作为检测是否为HNPCC患者的重要标志物；与MSS(即微卫星稳定)的结直肠癌相比，携带有MSI-H的结直肠癌患者预后更好，并且二者药物反应也不一样，提示MSI-H可作为结直肠癌预后的独立预测因子，因此，MSI检测对结直肠癌患者意义重大。

2016年最新版美国国立综合癌症网络(National Comprehensive CancerNetwork，NCCN，2016Version 2)的结直肠癌治疗指南第一次明确指出“有结/直肠癌病史的全部患者均应检测MMR(错配修复)或MSI”，因为MSI-H(即高微卫星不稳定)的II期结直肠癌预后良好(单纯手术5y-OS率为80％)，且不能从5FU辅助化疗中获益(反而有害)。并且指南首次将PD-1单抗Pembrolizumab和Nivolumab推荐用于具有dMMR/MSI-H分子表型的mCRC末线治疗，充分说明了晚期结直肠癌中检测MMR及MSI的重要性。同时，由于遗传性结直肠癌相关基因较多，在2016最新的NCCN结直肠癌遗传风险评价指南中，建议有明显家族史的患者和家属采用多基因组合(panel)测序进行首次检测。

2017年，默沙东PD-1单抗Keytruda被美国FDA批准用于治疗携带MSI-H或错配修复缺陷(dMMR)的实体瘤患者,再次证明了MSI-H可以作为一种独立于肿瘤发病位置的泛癌种癌症标志物。因此，癌症的MSI检测至关重要。

目前MSI检测方法局限于组织检测，例如国内医院中开展的MMR基因检测通常仅包含MLH1和MSH2，部分同时包含MSH6以及PMS2，其阳性结果与MSI检测结果吻合率较低；仅有极少数医院开展了通过PCR法结合毛细管电泳法的MSI状态检测，且多为外送检测。该方法通常选择5-11个单核苷酸重复位点，长度为25bp左右，PCR扩增后通过毛细管电泳测量其长度分布区间，来确定样本的微卫星(不)稳定状态。该方法为目前的金标准检测方法。近来，基于二代测序的组织MSI检测方法已经证明与PCR-MSI有极高的一致率，可以在判断MSI状态的同时刻画基因组图谱，提供癌症诊断更丰富的信息。然而，这些方法都需要足够的肿瘤细胞占比。由于血浆循环肿瘤DNA(ctDNA)极少，基于组织的方法无法在血浆里推行。

肿瘤血检具有组织不具有的无创性，实时性，非组织特异性等特征，具有重要的临床意义。因此，本领域急需基于血浆的MSI检测方法，尤其是用于癌症，优选结直肠癌(例如肠癌)、胃癌或子宫内膜癌的无创诊断，预后评估，治疗方案的选择或遗传筛查中肿瘤血检MSI的方法。