[发明专利]重组型疫苗宿主蛋白抗体的制备方法及其应用

权利要求书

1.重组手足口病疫苗宿主蛋白抗体，其特征在于，其制备方法包括以下步骤：

A、汉逊酵母空载体表达菌株的构建

将汉逊酵母表达载体PMV-05通过电转化法转化汉逊酵母尿嘧啶缺陷型宿主菌AU-0501，经稳定化培养筛选获得重组汉逊酵母空载体表达菌株；

B、汉逊酵母HCP的制备

B 1、重组汉逊酵母空载体表达菌株发酵培养

将重组汉逊酵母空载体表达菌株接种到100ml一级种子培养基中，在33℃，200rpm摇床振荡培养20～24小时；然后全量接种于1000ml二级种子培养基中，在33℃，200rpm摇床振荡培养20～24小时之后全量接种至30L发酵罐中，其中装有12L发酵培养基，氨水调节发酵液pH值维持在5.0，发酵温度为30℃，转速控制在350-750rpm，空气流速0.5-1.0m³/h，高密度发酵需要纯氧补充，溶氧控制在20-60％，20～24h时发酵培养基中碳源耗尽，补加甘油共计2.0L，分5次补加0.40L/次，每次碳源耗尽，溶氧上升时补加甘油，菌体生长共计36～39h，湿菌重最高可达0.3～0.4g/ml；去阻遏阶段：转速750rpm，空气流速1.0m³/h，溶氧控制在20～60％，加入1L甘油和甲醇混合液进行去阻遏培养，36～54h之间；诱导阶段：54～96h之间进行甲醇诱导，溶氧维持在20～40％；发酵结束：92～96h时，待甲醇消耗完全，溶氧上升至80％以上，降温至20℃开始下罐发酵结束，6500rpm离心15min，收获发酵菌体；

其中，一级种子培养基：酵母提取物6.7g/L，硫酸铵5g/L，葡萄糖20g/L；

二级种子培养基：酵母提取物6.7g/L，硫酸铵5g/L，甘油20g/L；

发酵培养基：甘油23.333g/L、磷酸二氢铵11.667g/L、3.333g/L氯化钾、氯化钙2.500g/L、氯化钠0.333g/L、硫酸镁2.500g/L、乙二胺四乙酸钠0.167g/L；

甘油和甲醇混合液：甘油200ml，甲醇800ml；

B2、汉逊酵母HCP纯化

将发酵培养菌体用细胞裂解缓冲液重悬，使用高压匀浆机在压力1200bar的条件下破碎细胞2次；

将破碎后的细胞液倒入离心筒中，进行7000rpm离心50min，收集上清液，将收集的上清液中加入硫酸铵浓度至终浓度为30％；

将硫酸铵沉淀产物采用9000rpm离心50min，收集沉淀，并加入复溶缓冲液，搅拌40min，9000rpm离心50min，收集复溶上清液；

将复溶上清液以300KD的膜采用50mM Tris pH8.0进行超滤，收集超滤液；

将超滤液进行离子交换层析，以Capto Q为层析介质，采用50mM Tris pH8.0平衡8个柱体积后上样，采用洗脱液洗脱，收集UV280nm紫外吸收峰，并经0.22μm的除菌过滤器无菌过滤后即得汉逊酵母HCP；

其中，复溶缓冲液：20mM PBS，0.5M NaCl，pH7.2；

洗脱液：含有300mM NaCl的50mM Tris溶液；

C、汉逊酵母HCP抗体的制备

C1、兔子免疫

第一次免疫：取6ml稀释至1mg/ml的步骤B获得的宿主蛋白，加入6ml弗氏完全佐剂进行乳化，取一滴至水面不散开为乳化完全；用2ml注射器吸取弗氏完全佐剂乳化液2ml，乳化液中含1mg宿主蛋白，在颈部和背部皮下多点分别注入0.2mL；

第二次免疫：间隔10-14天后，进行二免；取6ml稀释至0.5mg/mL的宿主蛋白，加入弗氏不完全佐剂6ml乳化，取一滴至水面不散开为乳化完全；用2ml注射器吸取弗氏不完全佐剂乳化液2ml，乳化液中含0.5mg宿主蛋白，在颈部和背部皮下多点分别注入0.2mL；

第三次免疫：间隔10-14天后，进行三免，方法同第二次免疫；

第四次免疫：间隔10-14天后，进行四免，取6ml稀释至0.5mg/mL的宿主蛋白过滤，通过耳缘静脉注射1ml；

采血：四免14天后用心脏采血法采血；分离血清，分装后贮于-80℃以下冰箱保存，并测定血清效价；

C2、兔血清多抗纯化

层析柱：柱体积，即CV，为1ml，介质：GErProtein A FF；

样品处理：取血清7.5ml采用平衡液3倍稀释，0.45μm滤器过滤纯化备用；

层析柱处理：采用平衡液处理5～10个CV，1ml/min；

上样：上样量20ml，采用平衡液处理5～10个CV，1ml/min；

洗脱：在收集管中预先加入1ml中和液，收集洗脱产物；

柱再生：采用0.1M NaOH洗杂2～5个CV，水洗10个CV，20％乙醇10个CV保存；

其中，平衡液的配方为：磷酸氢二钠1.392g/L，一水磷酸二氢钠1.224g/L，氯化钠8.766g/L；中和液为1M Tris pH 9.0；

C3、抗体标记

称取20mg HRP溶解于5ml蒸馏水中；于上液中加入1ml新配的0.1M NaIO₄溶液，室温下避光搅拌20分钟；将上述溶液装入透析袋中，对1mM pH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜；加200μl 0.2M pH9.5碳酸盐缓冲液，使以上HRP的pH升高到9.0-9.5，然后立即加入40mg步骤C2制备得到的IgG，在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时；加0.5ml新配的4mg/mlNaBH₄液，混匀，再置4℃2小时；将上述液装入透析袋中，对0.15M pH7.4PBS透析，4℃过夜；在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时；3000rpm离心半小时，弃上清；沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M pH7.4的PBS中；将上述溶液装入透析袋中，对0.15M pH7.4的PBS缓冲盐水透析，去除铵离子后，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，按照1:1的体积加入甘油，分装后冰冻保存，并测定效价。

2.重组手足口病疫苗宿主蛋白检测试剂或试剂盒，其特征在于，所述检测试剂或试剂盒的有效成分为权利要求1所述的重组手足口病疫苗宿主蛋白抗体。