[发明专利]重组型疫苗宿主蛋白抗体的制备方法及其应用

说明书

本发明提供重组型疫苗宿主蛋白抗体的制备方法及其应用，先将用于制备重组型疫苗的不携带任何外源基因的表达载体导入到与制备所述重组型疫苗所用的完全相同的原核或真核宿主细胞内，构建转化体，培养扩繁这些转化体，并按照与制备所述重组型疫苗所采用的完全相同的方法提取、纯化得到重组型疫苗宿主蛋白；然后经动物免疫再经抗体纯化后制得重组型疫苗宿主蛋白抗体。本发明提供的抗体可应用于重组手足口病疫苗中宿主蛋白残留检测，不仅灵敏度高、重复性好、专属性好，而且适用于一些由汉逊酵母表达的生物制品的宿主蛋白残留的检测，因此应用前景十分广阔。

技术领域

本发明涉及疫苗质控方法，具体地说，涉及重组型疫苗宿主蛋白抗体的制备方法及其应用。

背景技术

重组手足口病疫苗是应用汉逊酵母表达系统研制的一种基因工程产品，主要用于预防婴幼儿的手足口病。在基因工程产品中残留的宿主细胞蛋白是影响制品纯度的重要因素，反复使用含有宿主细胞蛋白的制品有可能引起接种副反应，并且影响药物的疗效。宿主蛋白(Host cell protein，HCP)成分复杂，种类繁多，且会因生产工艺及纯化工艺的不同而发生变化。HCP在生物制品中的残留量反映的不仅是制品批间的一致性，而且还是衡量生物制品质量的一个重要指标。因此，为了充分保证疫苗的安全有效，开发灵敏度高、适用性好、重复性好的宿主蛋白检测方法至关重要。

目前，酵母宿主蛋白检测方法主要有酶联免疫法(ELISA)、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、毛细管电泳(CE)、等电聚焦(IEF)和高效液相层析(HPLC)等。《中国药典》三部(2015版)中宿主蛋白残留量检测方法采用酶联免疫法(ELISA)。ELISA检测方法中所用的抗宿主蛋白抗体通常是将宿主细胞破碎后，经过初步处理得到宿主蛋白，免疫动物后获得。宿主细胞破碎方法包括：有机试剂裂解；溶菌酶等酶类的酶促反应；超声、高压匀浆等物理破碎。初步处理方式包括：固液分离；超滤浓缩等。

常规的酵母HCP抗体制备方法，由于HCP分子量大小不一，成分复杂，各成分之间含量、免疫原性差异大，而不容易得到充分反映产品HCP残留的合适HCP抗体。这是因为，常规方法将酵母HCP全部成分免疫动物之后，获得抗体主要结合含量高、分子量大且免疫原性强的HCP成分，对于低含量、分子量小且免疫原性弱的HCP成分无结合能力。使用这种制备方法产生的抗体，会导致在通过ELISA(酶联免疫法)检测生物制品中HCP残留时灵敏度大大降低，并且由于部分低免疫原性的HCP成分无法检测而造成实际测定值偏低，不能充分反映出产品HCP的实际残留情况。

发明内容

本发明的目的是提供重组型疫苗宿主蛋白抗体(特别是重组手足口病疫苗宿主蛋白抗体)的制备方法及其应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供重组型疫苗宿主蛋白的制备方法，将用于制备重组型疫苗的不携带任何外源基因的表达载体导入到与制备所述重组型疫苗所用的完全相同的原核或真核宿主细胞内，构建转化体，然后培养扩繁这些转化体，并按照与制备所述重组型疫苗所采用的完全相同的方法提取、纯化蛋白，即得重组型疫苗宿主蛋白。

本发明中，所述重组型疫苗利用DNA重组技术制备得到，选定病原体编码有效抗原的基因片段，将该基因片段与载体重组后导入原核或真核宿主细胞内，通过培养扩繁这些转化体，从细胞培养物中提取、纯化目的蛋白，即为重组型疫苗。

所述重组型疫苗包括但不限于重组手足口病疫苗，包括重组EV71疫苗、重组CA6疫苗、重组CA10疫苗、重组CA16疫苗、重组CB3疫苗、重组CB5疫苗、重组E30疫苗。

本发明中，制备重组手足口病疫苗所使用的宿主细胞为酵母菌，优选多型汉逊酵母，更优选尿嘧啶缺陷型汉逊酵母AU-0501；和/或

本发明中，制备重组手足口病疫苗所使用的表达载体为含有甲醇氧化酶启动子或甲醛脱氢酶启动子的表达载体，优选为含有甲醇氧化酶启动子的表达载体PMV-05。