[发明专利]一种RFF2细胞的构建方法

权利要求书

1.一种RFF2细胞的构建方法，其特征在于，所述构建方法用于构建一种用于细胞免疫治疗的RFF2细胞，所述方法包括以下步骤：

S1)PBMC细胞负载致肿瘤突变的多肽，而后对负载多肽后的PBMC细胞进行一次多肽冲击；

S2)冲击后扩大培养，以得到FF细胞；

S3)以致肿瘤突变的多肽作为抗原直接刺激所述FF细胞以筛选精准多肽；

S4)以步骤S3筛选的精准多肽负载PBMC细胞，而后培养，并在培养过程中，以精准多肽进行多次多肽冲击；

S5)冲击后继续培养，得到RFF细胞；

S6)用单抗药对步骤S5所得RFF细胞进行免疫抑制性信号分子的封闭，以得到RFF2细胞，所述免疫抑制性信号分子包括：PD-1、Tim-3、LAG3、CTLA-4、BTLA、VISTA、CD160、TIGIT、2B4(CD244)。

2.根据权利要求1所述的RFF2细胞的构建方法，其特征在于，在步骤S2中，所述冲击后扩大培养，以得到FF细胞包括：

将多肽冲击后的PBMC细胞在预铺细胞刺激因子OKM-25的细胞培养装置中培养；

培养一段时间后，转移至含有培养液OKM-100+12％FBS的细胞培养装置中继续培养；

培养一段时间后，再转移至含有培养液OKM-200+5％FBS的细胞培养装置中继续培养。

3.根据权利要求1所述的RFF2细胞的构建方法，其特征在于，步骤S4中，重复多肽冲击3～4次。

4.根据权利要求4所述的RFF2细胞的构建方法，其特征在于，在步骤S4中，每隔3～4天进行一次多肽冲击。

5.根据权利要求1所述的RFF2细胞的构建方法，其特征在于，多肽冲击中，用浓度为10μg/mL～100μg/mL的多肽溶液进行多肽冲击。

6.根据权利要求1所述的RFF2细胞的构建方法，其特征在于，步骤S4中，将负载精准多肽后的PBMC细胞在预铺细胞刺激因子OKM-25的细胞培养装置中培养，培养一段时间后用所得精准多肽进行多肽冲击，冲击时间1～4h；

转移至含有培养液OKM-100+12％FBS的细胞培养装置(培养板或培养瓶)中继续培养，每隔3～4天再次用所确定的精准多肽进行多肽冲击，冲击时间1～4h。

7.根据权利要求1所述的RFF2细胞的构建方法，其特征在于，所述致肿瘤突变的多肽由以下方法合成得到：

1)外显子测序

对肿瘤细胞进行全外显子测序；

将全外显子测序结果与正常细胞的基因组相比，筛选出突变的氨基酸位点；

2)抗原表位预测

以突变的氨基酸位点为中心，向两侧延伸10个氨基酸，将一段21个氨基酸的多肽作为潜在抗原表位；

IC50＜1000nM则认为此潜在抗原表位为抗原表位；

3)合成多肽

采用多肽固相合成法合成抗原表位肽。

8.根据权利要求7所述的RFF2细胞的构建方法，其特征在于，所述肿瘤细胞来源于工程细胞系，包括H1299、H226、H358、H1563、H2228、A549、Renca、LLC小鼠Lewis肺癌细胞、CRL-6323B16F1、CRL-2539 4T1、U14小鼠子宫颈癌细胞、BV-2小鼠小胶质瘤细胞、G422小鼠神经胶质瘤细胞。

9.根据权利要求1所述的RFF2细胞的构建方法，其特征在于，步骤S6中，将步骤S5所得RFF细胞以OKM-200+5％FBS进行重悬，而后加入终浓度为50～200μg/mL的单抗药，对RFF细胞的免疫抑制性信号分子进行封闭。