[发明专利]一种RFF2细胞的构建方法

说明书

本发明公开提供了一种RFF2细胞的构建方法，属于生物技术领域。本发明公开用于构建一种攻防兼顾、具有特异性杀伤作用的特异性T细胞，即一种用于细胞免疫治疗的RFF2细胞，精准性好、杀伤率高。所述构建方法包括以下步骤：PBMC细胞负载致肿瘤突变的多肽，而后对负载多肽后的PBMC细胞进行多肽冲击；冲击后扩大培养，以得到FF细胞；以致肿瘤突变的多肽作为抗原直接刺激该FF细胞以筛选精准多肽；以精准多肽负载PBMC细胞，而后培养，并在培养过程中，用精准多肽进行多次冲击；冲击后继续培养，得到RFF细胞；用PD1等抗体对所得RFF细胞进行免疫抑制性信号分子体外封闭，以得到RFF2细胞。所述构建方法可用于细胞免疫治疗技术。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种RFF2细胞的构建方法。

背景技术

肿瘤细胞免疫治疗是一种新兴的肿瘤治疗模式，它从病人体内采集免疫细胞，然后进行体外培养和扩增，再回输到病人体内，来激发以及增强机体的自身免疫功能以治疗肿瘤。肿瘤细胞免疫治疗是继手术、放疗和化疗之后的第四种肿瘤治疗方法。

正常或生物工程改造过的人体细胞移植或输入患者体内，新输入的细胞可以替代受损细胞、或者具有更强的免疫杀伤功能，从而达到治疗疾病的目的。

生物工程改造过的细胞用特殊方法在体外培养过程中加以改造，可提高其杀伤性，有效杀除患者体内肿瘤细胞。如，中国专利申请CN201210194280.5提供了一种人细胞因子诱导的杀伤细胞。中国专利申请CN201510034781.0提供一种肿瘤细胞特异性多克隆T细胞。中国专利申请CN201510013987.5提供一种抗肿瘤T细胞及其制备方法。中国专利申请CN201711060030.1提供一种治疗艾滋病合并淋巴瘤的CAR-T细胞及其制备方法和应用。中国专利申请CN201610824893.0提供一种抗体调控的双抗原特异性T细胞及其制备方法和应用。

发明内容

本发明旨在提供一种RFF2细胞的构建方法，以便构建一种新的用于细胞免疫治疗的特异性T细胞(命名为RFF2细胞)。通过联合多肽冲击和细胞体外扩增、体外封闭，提供一种具有特异性杀伤作用、攻防一体的T细胞，解决了免疫细胞在细胞免疫治疗中攻防不能兼顾的问题，精准性好、杀伤率高。

本发明提供一种RFF2细胞的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：

S1)PBMC细胞负载致肿瘤突变的多肽，而后对负载多肽后的PBMC细胞进行一次多肽冲击；

S2)冲击后扩大培养，以得到FF细胞；

S3)以致肿瘤突变的多肽作为抗原直接刺激所述FF细胞以筛选精准多肽；

S4)以步骤S3筛选的精准多肽负载PBMC细胞，而后培养，并在培养过程中，以精准多肽进行多次冲击；

S5)冲击后继续培养，得到RFF细胞；

S6)用单抗药对步骤S5所得RFF细胞进行免疫抑制性信号分子封闭，以得到RFF2细胞，所述免疫抑制性信号分子包括：PD-1、Tim-3、LAG3、CTLA-4、BTLA、VISTA、CD160、TIGIT、2B4(CD244)。

进一步地，在步骤S2中，所述冲击后扩大培养，得到FF细胞包括：将多肽冲击后的PBMC细胞在预铺细胞刺激因子OKM-25的细胞培养装置中培养；

培养一段时间后，转移至含有培养液OKM-100+12％FBS的细胞培养装置中继续培养；

培养一段时间后，再转移至含有培养液OKM-200+5％FBS的细胞培养装置中继续培养。

进一步地，步骤S4中，重复多肽冲击3～4次。

进一步地，多肽冲击中，用浓度为10μg/mL～100μg/mL的多肽溶液进行多肽冲击。