[发明专利]一种全自动核酸单链制备方法

说明书

本发明公开了一种全自动核酸单链制备方法。该方法利用核酸提取仪制备核酸单链，包括如下步骤：核酸扩增产物包含生物素标记的双链核酸；磁珠表面耦联了可识别生物素的功能基团；所述生物素可以和磁珠表面的功能基团结合；通过磁吸方式使磁珠富集，同时使标记了生物素的核酸同步富集、包被到磁珠表面；变性溶液使得富集包被到磁珠表面的双链核酸变成单链核酸；通过磁吸方式吸取包被了核酸的磁珠，加入到后续反应液中。本发明公开的核酸单链制备方法可以快速、高效地制备单链核酸，实现自动化和高通量化。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种全自动核酸单链制备方法。

背景技术

近年来，随着经济社会的不断发展，单链核酸杂交技术成为了现代医学生物学等领域诊断与检测的重要手段，常用的核酸单链制备方法包括：热变性法、碱处理法、T7逆转录法、变性高效液相色谱法和不对称PCR。

热变性法：高温使核酸由双链解为单链，操作简单，但制备得到的单链需保存于特定条件，且该方法仅适用于耐高温试剂，对于常温或低温试剂有较大局限性。

T7逆转录法：该方法是在PCR引物5’端加上T7启动子，以纯化PCR扩增产物为模板，用T7RNA聚合酶体外逆转录合成单链RNA。该方法虽然单链得率较高，但需要两步完成，操作不方便，且需要严格控制RNA酶的污染。

核酸外切酶法：由于一条PCR引物被磷酸化，PCR产物在用核酸外切酶消化时，被磷酸化的引物扩增链不被切割，最终得到的PCR产物还需要再纯化，操作不方便，且消化后酶被加热灭活，而单链得率依赖外切酶活性。

变性高效液相色谱法：由于一条PCR引物被生物素标记，其PCR扩增链在DHPLC时，会与另一条普通链分开，该方法可以15分钟内直接从双链PCR产物获得所需单链，但需要昂贵的仪器，难以普及。

不对称PCR：用两条不等量的引物进行扩增，得到大量目的单链DNA的方法。相比普通PCR，该方法对核酸量要求较高，灵敏度低。

这些方法都需要高度依赖技术人员的操作，人工操作虽然更灵活，但是误差大、效率低，不能实现快速、高效的制备核酸单链。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种全自动核酸单链制备方法。该方法借助磁珠，通过富集、变性等流程，利用核酸提取仪实现核酸单链制备的全自动化，准确且高效。

本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

一种全自动核酸单链制备方法，将待处理的标记了生物素的核酸扩增产物和试剂加入加样板中，再将加样板放入全自动核酸提取仪内，启动预先设置好的程序，按以下(1)-(4)的步骤完成全自动核酸单链制备：

(1)核酸提取仪按照预先设置好的混匀参数，将待处理的标记了生物素的核酸扩增产物和结合液的混合物进行混匀，获得混匀液A；

(2)核酸提取仪按照预先设置好的磁吸参数，从磁珠液中吸取磁珠，并加入到混匀液A中，再按照预先设置好的混匀参数进行混匀，获得混匀液B，所述磁珠表面偶联有可识别生物素的功能基团，使标记了生物素的核酸富集包被到磁珠表面；

(3)核酸提取仪按照预先设置好的磁吸参数，从混匀液B吸取包被了核酸的磁珠，并加入到变性溶液中，再按照预先设置好的混匀参数进行混匀，获得混匀液C，使富集包被到磁珠表面的双链核酸变成单链核酸；

(4)核酸提取仪按照预先设置好的磁吸参数，从混匀液C吸取包被了单链核酸的磁珠，加入到后续反应液中。

本发明上述方法的原理是：磁珠表面耦联了可识别生物素的功能基团，核酸扩增产物包含生物素标记的双链核酸，所述生物素可以和磁珠表面的功能基团结合，通过磁吸使包被了生物素标记的双链核酸的磁珠富集，同时使标记了生物素的核酸也同步富集到磁珠表面；变性溶液使得富集包被到磁珠表面的双链核酸变成单链核酸。