[发明专利]一种用于定量测定粪便中幽门螺杆菌抗原试剂的制备方法

权利要求书

1.一种用于定量测定粪便中幽门螺杆菌抗原试剂的制备方法，其特征在于，包括制备R2试剂的步骤：

S1、提取幽门螺杆菌抗原蛋白，将尿素酶基因克隆到质粒中，通过大肠杆菌发酵表达，得到重组幽门螺杆菌抗原；

S2、制备抗幽门螺杆菌抗原多克隆抗体；

S3、制备包被抗幽门螺杆菌抗原多克隆抗体的乳胶颗粒；

S4、将包被抗幽门螺杆菌抗原多克隆抗体的乳胶颗粒与含有0.1％-10％电解质、0.1％-10％稳定剂、0.1％-10％表面活性剂、0.1％-5％防腐剂和1-1000mmol/L的MES缓冲液混合，即得。

2.根据权利要求1所述的用于定量测定粪便中幽门螺杆菌抗原试剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S1具体为，选择尿素酶做为幽门螺杆菌抗原，所述尿素酶包括UreA和UreB蛋白亚基，将UreA或UreB基因克隆到质粒中，通过大肠杆菌发酵表达以及亲和层析纯化，即得幽门螺杆菌抗原，所述质粒包括但不限于pGEX-4T-1质粒，所述质粒包含蛋白标签基因，所述蛋白标签包括但不限于GST蛋白。

3.根据权利要求2所述的用于定量测定粪便中幽门螺杆菌抗原试剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S2包括：

S21、将幽门螺杆菌抗原用等量弗氏完全佐剂乳化；

S22、将乳化后的抗原进行动物皮下注射，进行免疫反应；

S23、取经过免疫的血清进行亲和层析处理后即得抗幽门螺杆菌抗原多克隆抗体。

4.根据权利要求3所述的用于定量测定粪便中幽门螺杆菌抗原试剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S3包括如下步骤：

S31、将乳胶颗粒与缓冲溶液混合并加入表面活性剂，得到乳胶颗粒溶液，所述乳胶颗粒占所述乳胶颗粒溶液的质量百分比为0.01-10％；

S32、将所述抗幽门螺杆菌抗原多克隆抗体溶解于缓冲溶液得到抗体溶液，所述抗幽门螺杆菌抗原多克隆抗体占抗体溶液的质量百分比为0.01-10％；

S33、将所述乳胶颗粒溶液与所述抗体溶液混合后，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐占混合溶液的质量百分比为0.01％-5％，室温下反应2-4小时，得到包被抗幽门螺杆菌抗原多克隆抗体的乳胶颗粒。

5.根据权利要求4所述的用于定量测定粪便中幽门螺杆菌抗原试剂的制备方法，其特征在于，还包括制备R1试剂的步骤，所述R1试剂包括0.1％-10％的电解质、0.1％-10％的稳定剂、0.1％-10％的表面活性剂、0.1％-5％的防腐剂，余量为浓度1-1000mmol/L的MES缓冲液。

6.根据权利要求5所述的用于定量测定粪便中幽门螺杆菌抗原试剂的制备方法，其特征在于，还包括制备校准品的步骤：以重组幽门螺杆菌抗原为母液，用牛血清蛋白溶液梯度稀释所述重组幽门螺杆菌抗原，即得不同浓度的校准品，所述牛血清蛋白溶液的浓度为1ng/ml-100g/l。

7.根据权利要求6所述的用于定量测定粪便中幽门螺杆菌抗原试剂的制备方法，其特征在于，所述R1试剂、R2试剂中的所述电解质包括但不限于氯化钠，所述稳定剂包括但不限于甘露醇，所述表面活性剂包括但不限于吐温80，防腐剂包括但不限于叠氮钠。

8.根据权利要求7所述的用于定量测定粪便中幽门螺杆菌抗原试剂的制备方法，其特征在于，所述乳胶颗粒的粒径为50-500nm。

9.根据权利要求8所述的用于定量测定粪便中幽门螺杆菌抗原试剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S22中所述动物皮下注射进行免疫反应共进行4次；所述步骤S23中，经亲和层析处理后的多克隆抗体在透析袋中置于TBS缓冲液中，在4℃下透析过夜，所述TBS缓冲溶液包括含20mM的Tris、500mM的NaCl、0.05％的Tween-20，其pH为7.4。

10.根据权利要求9所述的用于定量测定粪便中幽门螺杆菌抗原试剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S32采用的缓冲溶液为50mM、pH 6.0的MES缓冲溶液或PBS缓冲溶液。