[发明专利]人GDNF基因在牛β-casein基因座定位整合的载体及其应用有效
| 申请号： | 201811160162.6 | 申请日： | 2018-09-30 |
| 公开（公告）号： | CN109207521B | 公开（公告）日： | 2021-11-23 |
| 发明（设计）人： | 张学明;虞飞;丁海麦 | 申请（专利权）人： | 张学明 |
| 主分类号： | C12N15/85 | 分类号： | C12N15/85;C12N15/90;A01K67/027 |
| 代理公司： | 重庆乐泰知识产权代理事务所(普通合伙) 50221 | 代理人： | 付金星 |
| 地址： | 014000 内蒙古*** | 国省代码： | 内蒙古;15 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | gdnf 基因 casein 定位 整合 载体 及其 应用 | ||
1.人GDNF基因在牛β-casein基因座上定位整合的载体，包含打靶载体和特异性断裂打靶位点序列的CRISPR/Cas9表达载体，其中，所述打靶载体是基于同源重组原理设计的，包括正筛选基因，在正筛选基因的两端具有重组酶识别序列，所述重组酶识别序列的另一端分别与牛β-casein基因的5′同源臂和3′同源臂相连，人GDNF cDNA基因位于5′同源臂下游，所述CRISPR/Cas9表达载体，用于特异性地断裂打靶位点序列，包括引导序列sgRNA、Cas9蛋白序列和CRISPR结构序列，其中，sgRNA的靶基因位点在牛β-casein基因座第二外显子处，其靶位点序列为：CCAGGAATTGAGAGCCATGAAGG，扩增所述牛β-casein基因5′同源臂的引物为上游引物5'-ATTGGGCCCGTGTGTCAAGAGATTGTGATGG-3'，下游引物5'-CATCTCGAGCAAGTCCTGGGAATGGGAAGATG-3'。
2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述正筛选基因为编码新霉素磷酸转移酶的基因，即neo基因。
3.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述重组酶识别序列为Cre酶识别序列。
4.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，扩增所述牛β-casein基因3'同源臂的引物为上游引物5'-ATTGGATCCGGTCCTCATCCTTGCCTGC-3'和下游引物5'-GCTGGATCCGCTCCTCCTCTATGGGATTTTCC-3'。
5.权利要求1-4任一项所述的载体在制备表达人GDNF蛋白的牛乳腺生物反应器中的应用。
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