[发明专利]人GDNF基因在牛β-casein基因座定位整合的载体及其应用

说明书

本发明提供了人GDNF基因在牛β‑casein基因座上定位整合的打靶载体和特异性断裂打靶位点序列的CRISPR/Cas9表达载体。打靶载体是基于同源重组原理设计的，包括正筛选基因，在正筛选基因的两端具有重组酶识别序列，所述重组酶识别序列的另一端分别与牛β‑casein基因的5′同源臂和3′同源臂相连，人GDNF cDNA基因位于5′同源臂下游；CRISPR/Cas9表达载体，用于特异性地断裂打靶位点序列，包括引导序列sgRNA、Cas9蛋白序列和CRISPR结构序列。本发明还提供了所述载体用于获得人GDNF cDNA基因在牛β‑casein基因座上定位整合的牛胎儿成纤维细胞的应用。

技术领域

本发明涉及动物乳腺生物反应器，具体地说，涉及人GDNF基因在牛β-casein基因座定位整合的打靶载体和特异性断裂打靶位点序列的CRISPR/Cas9表达载体及其在制备高效表达人GDNF蛋白的牛乳腺生物反应器中的应用。

背景技术

众所周知，帕金森综合症(PD)是一种多巴胺能神经元退行性疾病，在中老年人群中发病率逐年升高，其特点是黑质多巴胺能神经元(DN)的损伤或丧失导致黑质纹状体内多巴胺含量下降，大部分是自发性的，还有些是环境毒性导致的脑损伤。然而，尽管有许多药物能够在一定程度上缓解PD的症状，但是，在帕金森病的治疗上效果仍然不是很明显，不仅不能根治，而且还对患者机体本身具有很大的副作用。最新的治疗PD的研究方案大多是提高多巴胺能神经元的存活率或者修复已损伤的多巴胺能神经元；研究发现，胶质细胞源性神经营养因子(本文简称“GDNF”)是一种强效的，相对特异的DN保护因子，能够很好的促进多巴胺能神经元的生长。

GDNF由Lin等在1993年从大鼠B49胶质瘤细胞中分离、纯化并成功克隆的一种神经营养因子，能特异地维持中脑多巴胺能神经元的存活和分化。GDNF是TGF-β超家族中一员，基因位于人染色体5p12-13.1区域，全长30kb，有三个外显子和两个内含子，表达出的GDNF蛋白是一种由211个氨基酸残基构成的前体合成的、典型的具有生物活性的分泌蛋白。GDNF营养神经作用的分子机理是通过与胶质细胞源性神经营养因子受体alpha(GFRαs)和受体酪氨酸激酶(RET)这两类受体亚基形成复合物后引起下游信号转导来介导的。GDNF蛋白在PD治疗上已进入二期临床研究。2006年，Lang等在利用重组人GDNF蛋白对PD患者进行为期六个月的临床治疗试验，但是，试验结果并不能有效的证明重组人GDNF蛋白对PD患者有效，并且治疗组患者还产生了一些不良反应，如：出现头疼、感觉异常等。同年，Slevin等改善药物输入方式和持续高剂量给药，一期试验中，向10例PD患者单侧壳核注入GDNF并持续6个月，PD患者的运动功能有明显改善，随后进入二期临床试验，在二期临床过程中有1例患者出现感染，7例患者体内产生抗体，随后终止临床试验，但是，GDNF在患者身上仍能表现出一定的疗效。直到2013年Patel等对单个病例进行观察研究，患者接受颅内壳核后背部注射GDNF，双侧壳核每天注射GDNF 14～43mg，持续39个月；在终止GDNF注射后36个月，患者的味觉嗅觉和性功能均有所改善，而且，没有发现副作用，表明GDNF对PD患者治疗安全有效，并有持续作用。在实验室的PD老鼠模型中，将GDNF转运到纹状体或黑质中，来保护多巴胺能神经元免受毒性损伤、修复已经损伤的多巴胺能神经元和促进运动功能的恢复。这种蛋白的研究使用，开辟了治疗PD的新的前景。

但是，GDNF在人和动物体内含量很低，从动物体中提取用于临床研究是不现实的，用转基因细胞生产，效率低，成本高，生产这种具有生物活性的糖基化蛋白不容易。现在合成蛋白质的方法主要有：化学合成法、组织提取法、微生物发酵法、哺乳动物细胞表达法、动物乳腺生物反应器制备等，其中化学合成法不能合成出具有生物活性的蛋白，而且副产物很多，不利于GDNF蛋白的体外合成；组织提取法、微生物发酵法、哺乳动物细胞表达法、不能大批量制备安全的、有生物活性的糖基化的GDNF蛋白；而动物乳腺生物反应器具有很多其他方法所不具备的优点，如：生产成本低、周期短，产品质量高、易纯化，产品活性高、无污染，外源基因在动物体内可稳定遗传、翻译后加工等。故选用动物乳腺生物反应器制备具有生物活性的糖基化GDNF蛋白是一种理想的方法。